Современные проблемы науки и образования. Экспериментальные модели Результаты и обсуждение

Первоначальный смысл понятия "атеросклероз", предложенного Маршаном в 1904 г., сводился лишь к двум типам изменений: скоплению жировых веществ в виде кашицеобразных масс во внутренней оболочке артерий (от греч. athere - каша) и собственно склерозу - соединительнотканному уплотнению стенки артерий (от греч. scleras - твердый). Современное толкование атеросклероза гораздо шире и включает в себя... "различные сочетания изменений интимы артерий, проявляющиеся в виде очагового отложения липидов, сложных соединений углеводов, элементов крови и циркулирующих в ней продуктов, образования соединительной ткани и отложения кальция" (определение ВОЗ).

Склеротически измененные сосуды (наиболее частая локализация - аорта, артерии сердца, мозга, нижних конечностей) отличаются повышенной плотностью и хрупкостью. Вследствие снижения эластических свойств они не в состоянии адекватно изменять свой просвет в зависимости от потребности органа или ткани в кровоснабжении.

Первоначально функциональная неполноценность склеротически измененных сосудов, а следовательно, органов и тканей обнаруживается только при предъявлении к ним повышенных требований, т. е. при увеличении нагрузки. Дальнейшее прогрессирование атеросклеротического процесса может привести к снижению работоспособности и в состоянии покоя.

Сильная степень атеросклеротического процесса, как правило, сопровождается сужением и даже полным закрытием просвета артерий. При медленном склерозировании артерий в органах с нарушенным кровоснабжением происходят атрофические изменения с постепенным замещением функционально активной паренхимы соединительной тканью.

Быстрое сужение или полное перекрытие просвета артерии (в случае тромбоза, тромбоэмболии или кровоизлияния в бляшку) ведет к омертвению участка органа с нарушенным кровообращением, т. е. к инфаркту. Инфаркт миокарда - наиболее часто встречающееся и наиболее грозное осложнение атеросклероза венечных артерий.

Экспериментальные модели. В 1912 г. Н. Н. Аничков и С. С. Халатов предложили способ моделирования атеросклероза у кроликов путем введения внутрь холестерина (через зонд или посредством примешивания к обычному корму). Выраженные атеросклеротические изменения развивались через несколько месяцев при ежедневном применении 0,5 - 0,1 г холестерина на 1 кг массы тела. Как правило, им сопутствовало повышение уровня холестерина в сыворотке крови (в 3 - 5 раз по сравнению с исходным уровнем), что явилось основанием для предположения о ведущей патогенетической роли в развитии атеросклероза гиперхолестеринемии . Эта модель легко воспроизводима не только у кроликов, но и у кур, голубей, обезьян, свиней.

У собак и крыс, резистентных к действию холестерина, атеросклероз воспроизводится путем комбинированного влияния холестерина и метилтиоурацила, который подавляет функцию щитовидной железы. Такое сочетание двух факторов (экзогенного и эндогенного) ведет к длительной и резкой гиперхолестеринемии (свыше 26 ммоль/л - 100 мг%). Добавление к пище сливочного масла и солей желчных кислот также способствует развитию атеросклероза.

У кур (петухов) экспериментальный атеросклероз аорты развивается после длительного (4 - 5 мес) воздействия диэтилстильбэстролом. В этом случае атеросклеротические изменения появляются на фоне эндогенной гиперхолестеринемии, возникающей вследствие нарушения гормональной регуляции обмена веществ.

Этиология. Приведенные экспериментальные примеры, а также наблюдение над спонтанным атеросклерозом человека, его эпидемиологией свидетельствуют о том, что данный патологический процесс развивается вследствие комбинированного действия ряда факторов (средовых, генетических, пищевых). В каждом отдельном случае на первый план выступает какой-нибудь один из них. Различают факторы, вызывающие атеросклероз, и факторы, способствующие его развитию.

На рис. 19.12 приведен перечень основных этиологических факторов (факторов риска) атерогенеза. Часть из них (наследственность, пол, возраст) относятся к эндогенным. Они проявляют свое действие с момента рождения (пол, наследственность) или на определенном этапе постнатального онтогенеза (возраст). Другие факторы относятся к экзогенным. С их действием организм человека сталкивается в самые различные возрастные периоды.

Роль наследственного фактора в возникновении атеросклероза подтверждают статистические данные о высокой частоте ишемической болезни сердца в отдельных семьях, а также у однояйцевых близнецов. Речь идет о наследственных формах гиперлипопротеидемии, генетических аномалиях клеточных рецепторов к липопротеидам.

Пол. В возрасте 40 - 80 лет атеросклерозом и инфарктом миокарда атеросклеротической природы мужчины болеют чаще, чем женщины (в среднем в 3 - 4 раза). После 70 лет заболеваемость атеросклерозом среди мужчин и женщин примерно одинакова. Это свидетельствует о том, что заболеваемость атеросклерозом среди женщин приходится на более поздний период. Указанные различия связаны, с одной стороны, с более низким исходным уровнем холестерина и содержанием его в основном во фракции неатерогенных а-липопротеидов сыворотки крови женщин, а с другой - с антисклеротическим действием женских половых гормонов. Снижение функции половых желез в связи с возрастом или по какой-либо другой причине (удаление яичников, их облучение) обусловливает увеличение в сыворотке крови уровня холестерина и резкое прогрессирование атеросклероза.

Предполагают, что защитное действие эстрогенов сводится не только к регуляции содержания холестерина в сыворотке крови, но и других видов обмена в артериальной стенке, в частности окислительного. Такое антисклеротическое действие эстрогенов проявляется преимущественно по отношению к венечным сосудам.

Возраст. Резкое увеличение частоты и тяжести атеросклеротического поражения сосудов в связи с возрастом, особенно заметное после 30 лет (см. рис. 19.12 ), породило у некоторых исследователей представление о том, что атеросклероз - функция возраста и является исключительно биологической проблемой [Давыдовский И. В., 1966]. Этим объясняется пессимистическое отношение к практическому решению проблемы в перспективе. Большинство исследователей, однако, придерживаются мнения, что возрастные и атеросклеротические изменения сосудов - это различные формы артериосклероза, особенно на поздних стадиях их развития, но возрастные изменения сосудов способствуют его развитию. Способствующее атеросклерозу действие возраста проявляется в виде местных структурных, физико-химических и биохимических изменений артериальной стенки и общих нарушений обмена веществ (гиперлипемия, гиперлипопротеидемия, гиперхолестеринемия) и его регуляции.

Избыточное питание. Экспериментальные исследования Н. Н. Аничкова и С. С. Халатова позволили предположить важность этиологической роли в возникновении спонтанного атеросклероза избыточного питания, в частности, избыточного поступления пищевых жиров. Опыт стран с высоким жизненным уровнем убедительно доказывает, что чем больше удовлетворяется потребность в энергии за счет животных жиров и содержащих холестерин продуктов, тем выше содержание холестерина в крови и процент заболеваемости атеросклерозом. Напротив, в странах, где на долю жиров животного происхождения приходится незначительная часть энергетической ценности суточного рациона (около 10%), заболеваемость атеросклерозом низкая (Япония, Китай).

В соответствии с разработанной в США программой, основанной на этих фактах, уменьшение потребления жиров с 40% от общего калоража до 30% к 2000 г. должно снизить смертность от инфаркта миокарда на 20 - 25%.

Стресс. Заболеваемость атеросклерозом выше среди людей "стрессовых профессий", т. е. профессий, требующих длительного и сильного нервного напряжения (врачи, учителя, преподаватели, работники управленческого аппарата, летчики и др.).

В целом заболеваемость атеросклерозом выше среди городского населения по сравнению с сельским. Это может быть объяснено тем, что в условиях большого города человек чаще подвергается нейрогенным стрессовым влияниям. Эксперименты подтверждают возможную роль нервно-психического стресса в возникновении атеросклероза. Сочетание диеты, содержащей большое количество жиров, с нервным напряжением должно рассматриваться как неблагоприятное.

Гиподинамия. Малоподвижный образ жизни, резкое уменьшение физической нагрузки (гиподинамия), свойственные человеку второй половины XX в., - еще один важный фактор атерогенеза. В пользу этого положения свидетельствуют меньшая заболеваемость атеросклерозом среди работников физического труда и большая - у лиц, занимающихся умственным трудом; более быстрая нормализация уровня холестерина в сыворотке крови после избыточного поступления его извне под действием физической нагрузки.

В эксперименте обнаружены выраженные атеросклеротические изменения в артериях кроликов после помещения их в специальные клетки, значительно уменьшающие их двигательную активность. Особенную атерогенную опасность представляет сочетание малоподвижного образа жизни и избыточного питания.

Интоксикация . Влияние алкоголя, никотина, интоксикация бактериального происхождения и интоксикация, вызванная различными химическими веществами (фториды, СO, H 2 S, свинец, бензол, соединения ртути), также являются факторами, способствующими развитию атеросклероза. В большинстве рассмотренных интоксикаций отмечались не только общие нарушения жирового обмена, свойственные атеросклерозу, но и типичные дистрофические и инфильтративно-пролиферативные изменения в артериальной стенке.

Артериальная гипертензия самостоятельного значения фактора риска, по-видимому, не имеет. Об этом свидетельствует опыт стран (Япония, Китай), население которых часто болеет гипертонической болезнью и редко - атеросклерозом. Однако повышенное артериальное давление приобретает значение способствующего развитию атеросклероза

фактора в комбинации с другими, особенно если оно превышает 160/90 мм рт. ст. Так, при одинаковом уровне холестерина заболеваемость инфарктом миокарда при гипертензии в пять раз выше, чем при нормальном артериальном давлении. В эксперименте на кроликах, в пищу которых добавляли холестерин, атеросклеротические изменения развиваются быстрее и достигают большей степени на фоне гипертензии.

Гормональные нарушения, болезни обмена веществ. В некоторых случаях атеросклероз возникает на фоне предшествующих гормональных нарушений (сахарный диабет, микседема, понижение функции половых желез) или болезней обмена веществ (подагра, ожирение, ксантоматоз, наследственные формы гиперлипопротеидемии и гиперхолестеринемии). Об этиологической роли гормональных нарушений в развитии атеросклероза свидетельствуют и приведенные выше опыты по экспериментальному воспроизведению этой патологии у животных путем влияния на эндокринные железы.

Патогенез. Существующие теории патогенеза атеросклероза можно свести к двум, принципиально отличающимся по своим ответам на вопрос: что первично, а что вторично при атеросклерозе, другими словами, что является причиной, а что следствием - липоидоз внутренней оболочки артерий или дегенеративно-пролиферативные изменения последней. Этот вопрос впервые был поставлен Р. Вирховым (1856). Он же первый и ответил на него, указав, что "при всех условиях процесс, вероятно, начинается с определенного разрыхления соединительнотканного основного вещества, из которого большей частью состоит внутренний слой артерий".

С тех пор и берет начало представление немецкой школы патологов и ее последователей в других странах, согласно которому при атеросклерозе первоначально развиваются дистрофические изменения внутренней оболочки стенки артерий, а отложение липидов и солей кальция - явление вторичного порядка. Преимуществом данной концепции является то, что она в состоянии объяснить развитие спонтанного и экспериментального атеросклероза как в тех случаях, когда имеются выраженные нарушения холестеринового обмена, так и при их отсутствии. Первостепенную роль авторы указанной концепции отводят артериальной стенке, т. е. субстрату, который непосредственно вовлекается в патологический процесс. "Атеросклероз является не только и даже не столько отражением общих обменных сдвигов (лабораторно они могут быть даже неуловимы), сколько производным собственных структурных, физических и химических превращений субстрата артериальной стенки... Первичный фактор, ведущий к атеросклерозу, лежит именно в самой артериальной стенке, в ее структуре и в ее энзимной системе" [Давыдовский И. В., 1966].

В противоположность этим взглядам со времени опытов Н. Н. Аничкова и С. С. Халатова, главным образом благодаря исследованиям отечественных и американских авторов, успешно развивается концепция о роли в развитии атеросклероза общих метаболических нарушений в организме, сопровождающихся гиперхолестеринемией, гипер- и дислипопротеидемией. С этих позиций, атеросклероз - следствие первичной диффузной инфильтрации липидов, в частности холестерина, в неизмененную внутреннюю оболочку артерий. Дальнейшие изменения в сосудистой стенке (явления мукоидного отека, дистрофические изменения волокнистых структур и клеточных элементов подэндотелиального слоя, продуктивные изменения) развиваются в связи с наличием в ней липидов, т. е. являются вторичными.

Первоначально ведущая роль в повышении уровня липидов, особенно холестерина, в крови приписывалась алиментарному фактору (избыточному питанию), что дало название и соответствующей теории возникновения атеросклероза - алиментарной . Однако очень скоро ее пришлось дополнить, так как стало очевидным, что не все случаи атеросклероза можно поставить в причинную связь с алиментарной гиперхолестеринемией. Согласно комбинационной теории Н. Н. Аничкова, в развитии атеросклероза, кроме алиментарного фактора, имеют значение эндогенные нарушения липидного обмена и его регуляции, механическое влияние на стенку сосуда, изменения артериального давления, главным образом его повышение, а также дистрофические изменения в самой артериальной стенке. В этой комбинации причин и механизмов атерогенеза одни (алиментарная и/или эндогенная гиперхолестеринемия) играют роль инициального фактора. Другие либо обеспечивают увеличенное поступление холестерина в стенку сосуда, либо уменьшают его экскрецию из нее через лимфатические сосуды.

В крови холестерин содержится в составе хиломикронов (мелкодисперсных частиц, не растворенных в плазме) и липопротеидов - надмолекулярных гетерогенных комплексов триглицеридов, эфиров холестерина (ядро), фосфолипидов, холестерина и специфических белков (апопротеиды: АПО А, В, С, Е), образующих поверхностный слой. Существуют определенные отличия липопротеидов по размерам, соотношению ядра и оболочки, качественному составу и атерогенности.

Выделены 4 основные фракции липопротеидов плазмы крови в зависимости от плотности и электрофоретической подвижности.

Обращает на себя внимание высокое содержание белка и низкое - липидов во фракции липопротеидов высокой плотности (ЛПВП - α-липопротеиды) и, наоборот, низкое содержание белка и высокое - липидов во фракциях хиломикронов, липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП - пре- β -липопротеиды) и липопротеидов низкой плотности (ЛПНП - β-липопротеиды).

Таким образом, липопротеиды плазмы крови осуществляют доставку синтезированных и полученных с пищей холестерина и триглицеридов к местам их использования и депонирования.

ЛПВП оказывают антиатерогенное действие путем обратного транспорта холестерина из клеток, в том числе из сосудов, к печени с последующим выведением из организма в форме желчных кислот. Остальные фракции липопротеидов (особенно ЛПНП) являются атерогенными, обусловливая избыточное накопление холестерина в стенке сосудов.

В табл. 5 приведена классификация первичных (генетически обусловленных) и вторичных (приобретенных) гиперлипопротеидемий с той или иной степенью выраженности атерогенного действия. Как следует из таблицы, в развитии атероматозных изменений сосудов основную роль играют ЛПНП и ЛПОНП, их повышенная концентрация в крови, избыточное поступление в интиму сосудов.

Избыточный транспорт ЛПНП и ЛПОНП в сосудистую стенку прошествует повреждению эндотелия.

В соответствии с концепцией американских исследователей И. Голдстайна и М. Брауна, ЛПНП и ЛПОНП в клетки поступают путем взаимодействия со специфическими рецепторами (АПО В, Е-реиепторы-гликопротеиды), после чего происходит их эндоцитозный захват и слияние с лизосомами. При этом ЛПНП расщепляются на белки и эфиры холестерина. Белки расщепляются на свободные аминокислоты, которые покидают клетку. Эфиры холестерина подвергаются гидролизу с образованием свободного холестерина, который поступает из лизосом в цитоплазму с последующим использованием для тех или иных целей (образование мембран, синтез стероидных гормонов и т. д.). Важно, что этот холестерин угнетает его синтез из эндогенных источников, при избытке образует "запасы" в форме эфиров холестерина и жирных кислот, но, самое главное, по механизму обратной связи угнетает синтез новых рецепторов для атерогенных липопротеидов и их дальнейшее поступление в клетку. Наряду с регулируемым рецепторопосредованным механизмом транспорта ЛП, обеспечивающим внутренние потребности клеток в холестерине, описан межэндотелиальный транспорт, а также так называемый нерегулируемый эндоцитоз, который представляет собой трансцеллюлярный, в том числе трансэндотелиальный везикулярный транспорт ЛПНП и ЛПОНП с последующим экзоцитозом (в интиму артерий из эндотелия, макрофагов, гладкомышечных клеток).

С учетом изложенных представлений механизм начального этапа атеросклероза , характеризующегося избыточным накоплением липидов в интиме артерий, может быть обусловлен:

1. Генетической аномалией рецептор-опосредованного эндоцитоза ЛПНП (отсутствие рецепторов - менее 2% от нормы, уменьшение их числа - 2 - 30% от нормы). Наличие таких дефектов обнаружено при семейной гиперхолестеринемии (гипербеталипопротеидемия II А типа) у гомо- и гетерозигот. Выведена линия кроликов (Ватанабе) с наследственным дефектом рецепторов к ЛПНП.

2. Перегрузкой рецепторопосредованного эндоцитоза при алиментарной гиперхолестеринемии. И в том, и в другом случае наступает резкое усиление нерегулируемого эндоцитозного захвата частиц ЛП эндотелиальными клетками, макрофагами и гладкомышечными клетками стенки сосудов вследствие выраженной гиперхолестеринемии.

3. Замедлением удаления атерогенных липопротеидов из стенки сосудов через лимфатическую систему в связи с гиперплазией, гипертензией, воспалительными изменениями.

Существенный дополнительный момент - различные превращения (модификации) липопротеидов в крови и сосудистой стенке. Речь идет об образовании в условиях гиперхолестеринемии аутоиммунных комплексов ЛП - IgG в крови, растворимых и нерастворимых комплексов ЛП с гликозаминогликанами, фибронектином, коллагеном и эластином в сосудистой стенке (А. Н. Климов, В. А. Нагорнев).

По сравнению с нативными ЛП захват модифицированных ЛП клетками интимы, в первую очередь макрофагами (с помощью нерегулируемых холестерином рецепторов), резко возрастает. Это, как полагают, является причиной превращения макрофагов в так называемые пенистые клетки, которые составляют морфологическую основу стадии липидных пятен и при дальнейшем прогрессировании - атером . Миграция кровяных макрофагов в интиму обеспечивается с помощью моноцитарного хемотаксического фактора, образующегося под действием ЛП и интерлейкина-1, который выделяется из самих моноцитов.

На заключительном этапе формируются фиброзные бляшки как ответ гладкомышечных клеток, фибробластов и макрофагов на повреждение, стимулируемый факторами роста тромбоцитов, эндотелиоцитов и гладкомышечных клеток, а также стадия осложненных поражений - кальцификация , тромбообразование и др. (рис. 19.13 ).

Приведенные выше концепции патогенеза атеросклероза имеют свои сильные и слабые стороны. Наиболее ценным достоинством концепции общих метаболических нарушений в организме и первичного липоидоза артериальной стенки является наличие экспериментальной холестериновой модели. Концепция первичного значения местных изменений в артериальной стенке, несмотря на то что была высказана более 100 лет назад, пока не имеет убедительной экспериментальной модели.

Как видно из изложенного, в целом они могут дополнять друг друга.

ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

УДК 612.017.1

И.В. Меньшиков, К.В. Фомина, Л.В. Бедулева, В.Г. Сергеев ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ АТЕРОСКЛЕРОЗА У КРЫС,

ВЫЗВАННОГО ИММУНИЗАЦИЕЙ НАТИВНЫМИ ЛИПОПРОТЕИНАМИ ЧЕЛОВЕКА

Иммунизация крыс нативными ЛПНП человека вызывает развитие аутоиммунной реакции против нативных ЛПНП, сопровождающейся дислипопротеинемией, увеличением объема периваскулярной и эпикардиальной жировой ткани и атеросклеротическим повреждением стенки аорты, что свидетельствует в пользу гипотезы о том, что аутоиммунная реакция против нативных ЛПНП является причиной развития этого заболевания. Атеросклероз у крыс, вызванный иммунизацией нативными ЛПНП, является адекватной экспериментальной моделью атеросклероза человека.

Ключевые слова: атерома, атеросклероз, аутоиммунные реакции, дислипидемия, нативные липопротеины низкой плотности, экспериментальная модель атеросклероза у крыс, эпикардиальный жир.

Введение

Атеросклероз лежит в основе широкого спектра кардиоваскулярных заболеваний и ассоциирован со многими аутоиммунными и инфекционными заболеваниями . Несмотря на многочисленные исследования, этиология и патогенез этого заболевания остаются неизвестными. Большинство современных гипотез основываются на ключевом факте связи между нарушением обмена липопро-теинов и формированием атеросклеротических бляшек. Однако почему и как происходит нарушение обмена липопротеинов, ведущее к развитию заболевания, остается главным невыясненным вопросом атерогенеза. В литературе обсуждается много внешних и внутренних факторов, ведущих к нарушению обмена липопротеинов, эти данные представлены в целом ряде обзоров . Одной из наиболее привлекательных сегодня гипотез является гипотеза об аутоиммунной природе атеросклероза, согласно которой причиной нарушения обмена липопротеинов является развитие аутоиммунной реакции против модифицированных (окисленных) липопротеинов низкой плотности (оЛПНП) . Образующиеся при этом иммунные комплексы аутоантител с оЛПНП формируют эффекторные механизмы, ведущие к воспалению в стенке сосуда. В соответствии с этой гипотезой уровень оЛПНП и аутоантител к ним должны быть ассоциированы с развитием атеросклероза. Однако однозначной связи между ними не обнаружено, а имеющиеся данные об уровне аутоантител к оЛПНП у больных атеросклерозом и здоровых людей противоречивы . Эти факты ставят под сомнение идею об аутоиммунной реакции против оЛПНП как причине индукции и развития атеросклероза. В то же время известны факты существования в норме аутоантител к нЛПНП, уровень которых при атеросклерозе существенно повышается . В исследованиях, проведенных нами ранее, было выявлено, что у больных атеросклерозом людей (пациенты с ишемической болезнью сердца) по сравнению со здоровыми был достоверно выше уровень антител к нЛПНП и ниже уровень антител к оЛПНП в крови . На основании этих и других фактов нами была сформулирована гипотеза о том, что основной причиной дислипопротеинемии и атерогенеза является развитие аутоиммунной реакции к нативным, а не к окисленным ЛПНП. В пользу нашей гипотезы также свидетельствуют сравнительно недавно полученные результаты исследований, указывающие на то, что аутоиммунные Т-клетки, распознающие эпитопы белка ApoB100 нЛПНП, способствуют развитию атеросклероза, тогда как ингибирование Т-клеточного ответа против нативных ЛПНП подавляет развитие атеросклероза . Одним из наиболее убедительных способов проверки гипотезы, направленной на определение этиологического фактора развития того или иного заболевания является возможность вызвать этим фактором развитие заболевания у экспериментальных животных. Поэтому с целью проверки гипотезы мы индуцировали аутоиммунную реакцию к нЛПНП у крыс путем иммунизации их нативными липопротеинами низкой плотности человека (чнЛПНП). В соответствии с гипотезой развитие аутоиммунной реакции против нЛПНП должно привести к развитию дислипопротеинемии, атеромы сосудов как наиболее значимых признаков, характеризующих развитие атеросклероза у человека.

Материалы и методика исследований

Крысы Wistar были иммунизированы нативными ЛПНП человека (Sigma) в составе неполного адъюванта Фрейнда (НАФ) (Sigma) однократно, внутрикожно в дозе 200 мкг. Контрольным животным вводили НАФ. Кровь забирали еженедельно в течение 13 недель кардиальной пункцией. Последний забор крови был выполнен через 20 недель после иммунизации. В сыворотке крови определяли уровень антител к нЛПНП человека, уровень общего холестерина, холестерина ЛПНП, холестерина ЛПВП. Антитела против нЛПНП определяли по методу, описанному Хлюстовым В.Н., 1999 . Общий холестерин определяли ферментативным методом с помощью набора Холестерин ФС («Диакон-ДС», Россия). Холестерин ЛПНП и ЛПВП определяли прямым гомогенным методом, используя коммерческие наборы «Холестерин ЛПНП», «Холестерин ЛПВП» (Human). Данные представляли как разницу (А) средних значений между группой опытных и контрольных животных. Для определения значимости различий был использован критерий Манна-Уитни. Через 20 недель после иммунизации каждой крысе была проведена интракардиальная перфузия фиксатором Иммунофикс. Сердце и часть аорты были окрашены на липиды суданом III (модифицированная методика Holman, 1958). Другая часть аорты подвергалась гистологическому исследованию, для этого сосуды были залиты в парафин. Срезы толщиной 6 мкм окрашивали гематоксилином-эозином.

Результаты и их обсуждение

Кинетика антител к нЛПНП, изменение уровня холестерина ЛПНП, холестерина ЛПВП в ходе иммунного ответа, вызванного иммунизацией крыс нативными ЛПНП человека. С целью проверки гипотезы о том, что причиной атерогенеза является развитие аутоиммунной реакции против нативных ЛПНП, мы попытались индуцировать аутоиммунную реакцию против нативных ЛПНП у крыс. Обычно для индукции аутоиммунных заболеваний у экспериментальных животных используют иммунизацию гетерологичными антигенами, сходными с аутоантигенами. Принято считать, что причиной развития аутоиммунной реакции при иммунизации гетерологичным антигеном является способность антигена вызвать активацию лимфоцитов, перекрестно реагирующих с аутоантигеном или активировать аутореактивные лимфоциты через идиотип-антиидиотипические взаимодействия, как было показано нами ранее на экспериментальных моделях аутоиммунной гемолитической анемии и коллаген-индуцированного артрита крыс . Поэтому для индукции аутоиммунной реакции против нативных ЛПНП у крыс мы использовали гетерологичные (человеческие) нативные ЛПНП.

Однократная иммунизация крыс нативными ЛПНП человека в НАФ в дозе 200 мкг вызвала рост уровня антител против нЛПНП человека, который происходил в течение 13 недель после иммунизации (рис. 1). Через 20 недель уровень антител оставался высоким. Рост антител против нативных ЛПНП человека в ходе иммунного ответа был ступенчатым, каждое новое повышение уровня антител к нативным ЛПНП человека носило спонтанный характер и достигало максимума быстрее, чем предыдущее. Такой самоподдерживающийся, самоусиливающийся характер развития иммунного ответа свойственен для развития реакций гиперчувствительности и аутоиммунных реакций.

Рост уровня антител к нЛПНП у иммунизированных крыс сопровождался повышением уровня холестерина ЛПНП и снижением холестерина ЛПВП относительно контрольных животных (рис. 1). Наблюдаемые изменения в обмене липопротеинов являются общепринятым признаком развития атеросклероза у человека.

Изменение уровня холестерина ЛПНП и холестерина ЛПВП в крови крыс, так же как и изменение уровня антител к нативным ЛПНП человека, имело ступенчатый характер. При этом изменение уровня холестерина ЛПНП и ЛПВП углубляются, становятся более выраженными с новой фазой роста антител (рис. 1). Сравнение кинетики антител к нЛПНП и уровня холестерина ЛПНП и ЛПВП в ходе иммунного ответа явно указывает на их взаимосвязь. Развитие дислипопротеинемии, наличие взаимосвязи между изменением уровня антител против нативных липопротеинов и дислипидемией в ходе иммунного ответа свидетельствует о развитии у крыс, иммунизированных нативными ЛПНП человека, аутоиммунной реакции к нативным ЛПНП крыс.

Рис. 1. Кинетика антител против нативных ЛПНП человека, изменение уровня холестерина ЛПНП и холестерина ЛПВП в крови крыс, иммунизированных нативными ЛПНП. Результаты представлены в виде разницы средних между группой иммунизированных нЛПНП крыс (п=8) и группой контрольных крыс (п=8). * - значимые различия по сравнению с контрольными животными р< 0,05, критерий Манна-Уитни

Развитие атеромы аорты у крыс, иммунизированных нативными ЛПНП человека. У контрольных крыс, которым однократно вводили НАФ, изменений в структуре аорты не обнаружено. Интима аорты крыс представлена в виде единственного эндотелиального слоя, который плотно прилегает к внутренней эластической мембране; медиа аорты состоит из нескольких слоев мышечных клеток и экстрацеллюлярного коллагенового матрикса, разделенного эластиновыми пластинками; адвентиция аорты представлена соединительной и жировой тканью (рис. 2а).

Гистологический анализ аорты экспериментальных крыс выявил изменения, характерные для атеросклероза. Наблюдается несколько видов изменений стенки аорты, которые могут рассматриваться как разные стадии развития атеросклеротических повреждений. На рис. 2б видно утолщение интимы, дезорганизация медии, обнаруживаются скопления лейкоцитов в интиме и между медиа и адвентицией, не просматривается elastic lamina, что может представлять собой ранние атеросклеротические повреждения сосудов. На рис 2в представлен участок аорты с более глубокими нарушениями интима-медиа комплекса. Наблюдаются участки полного разрушения интимы, вспучивания и обнажения медии. Таким образом, однократная иммунизация крыс нативными ЛПНП человека в НАФ вызывает повреждения стенки аорты, типичные для атеросклероза.

Рост объема эпикардиальной и периваскулярной жировой ткани у крыс, иммунизированных нативными ЛПНП человека. Однократная иммунизация крыс нативными ЛПНП человека вызвала увеличение объема эпикардиального жира (рис. 3). На рис. 3 видно, что сердце контрольного животного почти не имеет эпикардиального жира, тогда как у экспериментальных животных наблюдается его существенный объем. Увеличение объема эпикардиального жира у крыс, иммунизированных чнЛПНП, составляет 250±35%.

Рис. 2. Стенка аорты, окрашенная гематоксилином-эозином: а - стенка аорты контрольных крыс; б - стенка аорты крыс, иммунизированных нЛПНП. Наблюдаются утолщение интимы, дезорганизация медиа, накопление лейкоцитов в стенке сосуда. Elastic lamina не определяется; в - стенка аорты у крыс, иммунизированных нЛПНП. Участок полной деградации интимы, вспучивание и обнажение медиа. Длина линии = 1200 цт

Рис. 3. Сердце, контрольных крыс (1) и крыс, иммунизированных нЛПНП человека (2), окрашенное суданом. Темные области - эпикардиальный жир

У экспериментальных животных выявлено увеличение объема периваскулярной жировой ткани - количества и размеров адипоцитов белой жировой ткани в адвентициальной оболочке (рис. 4 а, б). Важно отметить, что при этом менялся и характер распределения липидов в адипоцитах бурой жировой ткани адвентиции аорты. В некоторых адипоцитах бурой жировой ткани мелкие липидные капли,

обычно диспергированные по всей цитоплазме, становились крупнее, сливались и локализовались в центре клеток (рис 4 в, г). Можно предположить, что в условиях эксперимента происходило не только увеличение количества клеток бурой жировой ткани аорты, но и их постепенное превращение в адипоциты белой жировой ткани.

Рис. 4. Периваскулярная жировая ткань: а - адипоциты аорты контрольных животных; б - адипоциты аорты крыс, иммунизированных нЛПНП; в, г - превращение адипоцитов бурой жировой ткани в адипоциты белой жировой ткани в адвентиции и периадвентиции аорты крыс, иммунизированных нЛПНП. (1*, 2*, 3* - последовательные стадии превращения адипоцитов); 1 - медиа; 2 - адвентиция; 3 - периадвентиция. Длина линии (A, B, C) = 1400 цт, D - 420 цт

В последнее время роли эпикардиальной и периваскулярной жировой ткани в патогенезе атеросклероза уделяется большое внимание . Увеличение объема эпикардиальной жировой ткани сегодня рассматривают как маркер коронарного атеросклероза и прогностический показатель его развития . Периваскулярная жировая ткань, окружающая артерии, также вовлечена в локальную стимуляцию образования атеросклеротических бляшек . Результаты in vitro и in vivo показали, что периваскулярная жировая ткань обладает провоспалительными свойствами и способна вызывать атеросклеротический процесс в стенке сосуда, что обосновывает гипотезу о том, что повреждение в стенке сосуда индуцируется с его внешней стороны . Поэтому выявленные нами повреждения внутренней стенки аорты у крыс могут быть вызваны реакцией периваскулярной жировой ткани на иммунизацию крыс нЛПНП человека.

В сущности, нами получена новая экспериментальная модель атеросклероза. Несмотря на то что известно много экспериментальных моделей атеросклероза , сегодня не существует адекватной модели, которая бы полностью воспроизводила все стадии и признаки атеросклероза человека . Разработанная нами экспериментальная модель атеросклероза у крыс, вызванная иммунизацией нативными ЛПНП человека, воспроизводит основные метаболические, патофизиологические признаки заболевания и тем самым является адекватной экспериментальной моделью атеросклероза человека. Экспериментальная модель открывает перспективу для изучения причинно-следственных связей между процессами, вовлеченными в патогенез атеросклероза; механизмов срыва естественной толерантности к нативным ЛПНП, ведущих к атеросклерозу; ассоциации атеросклероза с инфекциями и другими аутоиммунными заболеваниями.

Таким образом, иммунизация крыс нативными ЛПНП человека вызывает развитие аутоиммунной реакции против нативных ЛПНП, сопровождающейся дислипопротеинемией, увеличением объема периваскулярной и эпикардиальной жировой ткани и атеросклеротическим повреждением стенки аорты, что свидетельствует в пользу гипотезы о том, что аутоиммунная реакция против нативных

ЛПНП является причиной развития этого заболевания. Атеросклероз у крыс, вызванный иммунизацией нативными ЛПНП человека, является адекватной экспериментальной моделью атеросклероза человека.

Благодарности

Работа выполнена в рамках государственного заказа Министерства образования и науки РФ на проведение НИР по теме «Аутоиммунные механизмы атеросклероза. Новая экспериментальная модель атеросклероза у крыс» № 4.5505.2011.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Masia M., Padilla S., Robledano C. et al. Evaluation of endothelial function and subclinical atherosclerosis in association with hepatitis C virus in HIV-infected patients: a cross-sectional study // BMC Infect. Dis. 2011. Vol. 11. P. 265.

2. Muhlestein J.B. Chronic infection and coronary atherosclerosis will the hypothesis ever really pan out? // J. Am. Coll. Cardiol. 2011. Vol. 58. P. 2007-2009.

3. Stassen F.R., Vainas T., Bruggeman C.A. Infection and atherosclerosis. An alternative view on an outdated hypothesis // Pharmacol. Rep. 2008. Vol. 60. P. 85-92.

4. Symmons D.P., Gabriel S.E. Epidemiology of CVD in rheumatic disease, with a focus on RA and SLE // Nat. Rev. Rheumatol. 2011. Vol. 7. P. 399-408.

5. Galkina E., Ley K. Immune and Inflammatory Mechanisms of Atherosclerosis // Annu Rev. Immunol. 2009. Vol.

6. Libby P., Okamoto Y., Rocha V.Z. et al. Inflammation in Atherosclerosis:Transition From Theory to Practice // Circ. J. 2010. Vol. 74. P. 213-220.

7. Shah P.K. Residual risk and high-density lipoprotein cholesterol levels: is there a relationship? // Rev. Cardiovasc. Med. 2011. Vol. 12. P. 55-59.

8. Steinberg D. The LDL modification hypothesis of atherogenesis: an update // J. Lipid Res. 2009. Vol. 50. P. 376-381.

9. Klimov A.N. Autoimmune theory of atherogenesis and the concept of modified lipoproteins // Vestn. Akad. Med. Nauk SSSR. 1990. Vol. 11. P. 30-36.

10. Klimov A.N, Nagornev V.A. Evolution of cholesterol concept of atherogenesis from Anitchkov to our days // Pediatr. Pathol .Mol. Med. 2002. Vol. 21. P. 307-320.

11. Virella G., Lopes-Virella M.F. Atherogenesis and the humoral immune response to modified lipoproteins // Atherosclerosis. 2008. Vol. 200. P. 239-246.

12. Gounopoulos P., Merki E., Hansen L.F. et al. Antibodies to oxidized low density lipoprotein: epidemiological studies and potential clinical applications in cardiovascular disease // Minerva Cardioangiol. 2007. Vol. 55. P. 821-837.

13. Mandal K., Jahangiri M., Xu Q. Autoimmune mechanisms of atherosclerosis // Handb. Exp. Pharmacol. 2005. Vol. 170. P. 723-743.

14. Matsuura E., Kobayashi K., Inoue K. et al. Intravenous immunoglobulin and atherosclerosis // Clin. Rev. Allergy Immunol. 2005. Vol 29. P. 311-319.

15. Weinbrenner T., Cladellas M., Covas M.I. et al. High oxidative stress in patients with stable coronary heart disease // Atherosclerosis. 2003. Vol. 168. P. 99-106.

16. Хлюстов В.Н. Количественное определение аутоантител к липопротеинам низкой плотности // Клиническая лабораторная диагностика. 1999. № 4. С. 17-20.

17. Меньшиков И.В., Макарова М.И., Булатова Н.И. и др. Аутоиммунные реакции в патогенезе атеросклероза // Иммунология. 2010. № 5. С. 242-246.

18. Hermansson A., Ketelhuth D., Strodthoff D. et al. Inhibition of T-cell response to native low density lipoprotein reduces atherosclerosis // J. Exp. Med. 2010. Vol. 207. P. 1081-1093.

19. Rose N.R. Infection, mimics, and autoimmune disease. J. Clin. Invest. 2001. Vol. 107. Р. 943-944.

20. Wucherpfennig K.W. Mechanisms for the induction of autoimmunity by infectious agents // J. Clin. Invest. 2001. Vol. 108. P. 1097-1104.

21. Menshikov I., Beduleva L. Evidence in favor of a role of idiotypic network in autoimmune hemolytic anemia induction: theoretical and experimental studies // Int. Immunol. 2008. Vol. 20. P. 193-198.

22. Beduleva L., Menshikov I. Role of idiotype-anti-idiotype interactions in the induction of collagen-induced arthritis in rats // Immunobiology. 2010. Vol. 215. P. 963-970.

23. Djaberi R., Schuijf J.D., van Werkhoven J.M. et al. Relation of epicardial adipose tissue to coronary atherosclerosis // Am. J. Cardiol. 2008. Vol. 102. P. 1602-1607.

24. Verhagen S.N., Visseren F.L., Perivascular adipose tissue as a cause of atherosclerosis // Atherosclerosis. 2011. Vol. 214. P. 3-10.

25. Yorgun H., Canpolat U., Hazirolan T. et al. Epicardial adipose tissue thickness predicts descending thoracic aorta atherosclerosis shown by multidetector computed tomography // Int. J. Cardiovasc. Imaging. 2011.

26. Xiangdong L., Yuanwu L., Hua Z. et al. Animal models for the atherosclerosis research: a review // Protein Cell. 2011. Vol. 2. P. 189-201.

27. Russell J.C., Proctor S.D. Small animal models of cardiovascular disease: tools for the study of the roles of metabolic syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis // Cardiovasc. Pathol. 2006. Vol.15. P. 318-330.

28. Zaragoza C., Gomez-Guerrero C., Martin-Ventura J.L. et al. Animal Models of Cardiovascular Diseases // Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011. doi:10.1155/2011/497841.

Поступила в редакцию 02.12.11

I. V. Menshikov, K. V. Fomina, L. V. Beduleva, V. G. Sergeev

A new experimental murine model of atherosclerosis by immunization with human native low-density lipoproteins

Immunization of rats with native human LDL leads to anti-nLDL autoimmune reaction accompanied by an increase in LDL-С levels, a reduction in HDL-C, and an epicardial and perivascular increase in the adipose tissue volume, together with endothelial destruction and media disorder. The results achieved prove the hypothesis that autoimmune reaction to nLDL is the cause of atherosclerosis. Our murine model of atherosclerosis induced by heterologous nLDL reproduces key metabolic and pathologic features of human atherosclerosis and is a suitable experimental model of this disease.

Keywords: atheroma, atherosclerosis, autoimmunity, dyslipidemia, epicardial adipose tissue, native low-density lipoproteins, rat model of atherosclerosis.

Меньшиков Игорь Викторович,

ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет»

E-mail: [email protected]

Фомина Ксения Владимировна, инженер

ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет»

426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1)

E-mail:[email protected]

Бедулева Любовь Викторовна,

доктор биологических наук, профессор

ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет»

426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1)

E-mail: [email protected]

Сергеев Валерий Г еоргиевич,

доктор биологических наук, профессор

ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет»

426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1)

E-mail: [email protected]

Menshikov I.V., doctor of biology, professor Udmurt State University

426034,Russia, Izhevsk, Universitetskaya st., 1/1 E-mail: [email protected]

Fomina K.V., engineer Udmurt State University

426034,Russia, Izhevsk, Universitetskaya st., 1/1 E-mail: [email protected]

Beduleva L.V., doctor of biology, professor Udmurt State University

426034, Russia, Izhevsk, Universitetskaya st., 1/1 E-mail: [email protected]

Sergeev V.G., doctor of biology, professor Udmurt State University

426034,Russia, Izhevsk, Universitetskaya st., 1/1 E-mail: [email protected]

Рассмотрим особо проблему моделирования атеросклероза. Экспериментальная модель последнего показательна во многих отношениях.

Кролику, травоядному животному, вводится в желудочно-кишечный тракт в течение длительного периода огромное количество холестерина, т. е. фактически чуждого для него продукта питания. Но ведь на протяжении всей истории человечества продукты, содержащие холестерин, были нормальными ингредиентами питания. Огромное значение холестерина для многообразных функций организма отражается также в способности последнего синтезировать холестерин независимо от диеты, местом синтеза является, в частности, артериальная система, т. е. стенки артерий.

Чуждый для кролика продукт питания — холестерин — наводняет кровь и как инородное химическое тело, не имеющее в организме кролика адекватных ферментных систем, расщепляющих холестерин, или органов, способных выделить холестерин во внешнюю среду, в изобилии откладывается в ретикулоэндотелиальной системе и в артериальной системе, проходя ее эндотелиальный барьер. Такова общая судьба крупномолекулярных соединений (типа метилцеллюлозы, пектина, поливинилового алкоголя), не расщепляемых средствами организма и не выделяемых им.

Следовательно, с общетеоретических позиций, определяющих сущность всякой модели, получаемый у кроликов феномен имеет лишь внешнее сходство с артериосклерозом человека. Это сходство морфологическое, химическое, но не этиологическое (экологическое) и не патогенетическое.

Кроличья модель атеросклероза является, прежде всего, результатом неадекватного питания. Она не может, поэтому рассматриваться как модель человеческого атеросклероза и как модель обменных нарушений холестеринового обмена, хотя бы потому, что отложения чужеродных веществ не могут быть документацией нарушения обмена тех же веществ, так же как, например, отложения свинца в костях не документируют нарушений свинцового обмена.

И последнее: при атеросклерозе человека вопрос о нарушении холестеринового обмена решается скорее отрицательно.

Сказанное не исключает большого познавательного значения той же модели.

Последняя учит, что сосудистые барьеры — очень условное понятие и что через них могут свободно проходить крупномолекулярные соединения даже вне специальных дизорий, т. е. таких форм проницаемости сосудистых стенок, какие имеют место при отеках, воспалении. Модель подчеркивает также значение артериальной системы в улавливании всех циркулирующих химических соединений, вообще чуждых для организма или ставших таковыми в процессе, например, денатурации белковых тел (амилоидоз, гиалиноз).

Методологически важная сторона той же модели заключается еще в том, что в ней вскрывается опасность односторонних суждений, в данном случае основанных на чисто морфологической документации.

«Проблема причинности в медицине», И.В.Давыдовский

История экспериментального моделирования болезней поучительна во многих отношениях и прежде всего для решения принципиальных вопросов, связанных с этиологией. Она поучительна также и в плане общей методологии биологического эксперимента, его теоретических основ и практических выводов из него. Необходимо отдавать отчет в том, что всякая модель является известным упрощением, лишь более или менее наглядной копией оригинала, какой-то…

Всякий опыт является «насильственным испытанием природы» (И. Мюллер, Muller), ее законов. Сама «природа не нарушает своих законов» (Леонардо Да Винчи). Однако всякий опыт, всякое моделирование (инфекции, рака, гипертонии и т. д.) неизбежно сопряжено с каким-то нарушением законов и нередко с искажением последних, поскольку закон еще не известен экспериментатору и в основе соответствующих поисков лежат подчас…

Абсолютно решающего эксперимента, по-видимому, не существует, особенно в биологии, где так много неизвестных величин, затрудняющих постановку надежно контролируемого эксперимента. Если речь идет о теории, то эксперимент «не может полностью и окончательно подтвердить» ее потому, что «один и тот же результат может следовать из разных теорий». С наибольшей и все же с неабсолютной точностью эксперимент может…

Эксперимент должен отталкиваться от практики наблюдения и от тех теоретических построений которые эта практика порождает. Другими словами, сначала наблюдение, потом обобщающие мысли и идеи, из наблюдений вытекающие, и, наконец, моделирование. Следовательно, «необходимость эксперимента» вытекает из практического опыта, когда возникают и идеи и вопросы, как исходная точка для опыта (С. П. Боткин). Экспериментальный метод сам по…

Искусственное введение пневмококков кролику и получение у него пневмонии формально говорит о пневмококке как о причине инфекции. Однако хорошо известно, что пневмония обычно возникает спонтанно, т. е. аутоинфекционно, без какого-либо экзогенного заражения. Очевидно, что и сделанное заключение о пневмококке как причине или «главной причине» пневмонии годится только для указанной постановки опыта, т. е. для данной…

Глава 1. Обзор литературы

1. Гипотезы и теории патогенеза атеросклероза

1.1. Холестериновая теория атеросклероза

1.2. Гипотеза окислительной модификации

1.3. Инфекционное и аутоиммунное воспаление как причина развития атеросклероза

1.4. Эпикардиальный и периваскулярный жир как причина развития атеросклероза

2. Экспериментальные модели атеросклероза

2.1. Гиперхолестериновая диета как способ индукции атеросклероза экспериментальных животных

2.2. Генетические модели атеросклероза

2.3. Инфекционные модели атеросклероза

2.4. Аутоиммунные модели атеросклероза

Глава 2. Организация и методы исследований

2.1. Организация исследований

2.2. Материалы и методы исследований

Глава 3. Результаты исследований

3.1. Разработка схемы иммунизации крыс нативными ЛПНП человека, вызывающей гипериммунный ответ против нЛПНП

3.2. Кинетика антител против нативных ЛПНП человека, аутоантител против ЛПНП у крыс, иммунизированных нативными ЛПНП человека

3.3. Уровень фракций холестерина в сыворотке и липидный состав

надпочечников крыс, иммунизированных нативными ЛПНП человека

3.3.1. Холестерин липопротеинов низкой и высокой плотности у крыс,

иммунизированных нЛПНП человека

3.3.2. Липидный состав надпочечников крыс, иммунизированных нЛПНП

человека

3.4. Морфологический и гистологический анализ сердца и дуги аорты у

крыс, иммунизированных нативными ЛПНП человека

3.4.1. Изменения стенки дуги аорты у крыс, иммунизированных нЛПНП

человека

3.4.2.Эпикардиальный и периваскулярный жир у крыс,

иммунизированных нативными ЛПНП человека

Глава 4. Обсуждение результатов

4.1. Анализ адекватности экспериментальной модели атеросклероза крыс, вызванного иммунизацией нативными ЛПНП человека, атеросклерозу человека

4.2. Модель атеросклероза, вызванного иммунизацией нативными ЛПНП, как доказательство гипотезы, что аутоиммунная реакция против нативных ЛПНП является причиной развития дислипопротеинемии и

атеросклероза

Литература

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДГЭА - дегидроэпиандростерон

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИНСД - инсулиннезависимый сахарный диабет

ИФА - иммуноферментный анализ

ЛПВП - липопротеины высокой плотности

ЛПНП - липопротеины низкой плотности

НАФ - неполный адъювант Фрейнда

нЛПНП - нативные липопротеины низкой плотности

ПАФ - полный адъювант Фрейнда

ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания

ПЖТ - периваскулярная жировая ткань

ФР - физиологический раствор

ХС - холестерин

ЭЖТ - эпикардиальная жировая ткань

АроЕ-/-мыши - аполипопротеин Е-дефицитные мыши

1ЛЭЬК-/-мыши - мыши с дефицитом рецепторов для липопротеинов низкой плотности

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспериментальная модель атеросклероза у крыс, вызванного иммунизацией нативными липопротеинами низкой плотности человека»

Введение

Актуальность исследования

Атеросклероз лежит в основе широкого спектра кардиоваскулярных заболеваний. Несмотря на многочисленные исследования, этиология и патогенез этого заболевания остаются неизвестными. Выяснение механизмов индукции и развития атеросклероза у человека затруднено из-за многолетней преклинической стадии развития атеросклероза и недостатка неинвазивных форм его обнаружения . Вследствие этого большинство исследований на людях проводятся после появления клинических признаков заболевания, когда оно уже хорошо развито. Изучать причины возникновения атеросклероза, его ранние, доклинические стадии позволяют экспериментальные модели . Кроме того, возможность индукции атеросклероза у экспериментальных животных с помощью какого-либо воздействия является эффективным способом проверки роли тех или иных факторов в инициации развития атеросклероза.

Обсуждается много внешних и внутренних факторов, ведущих к атеросклерозу. Среди них - избыточное потребление холестерина, аутоиммунные реакции, воспаление, дефекты генов рецепторов липопротеинов . Экспериментальный атеросклероз вызывают в основном при помощи гиперхолестериновой диеты и генетических манипуляций, ведущих к нарушению обмена липопротеинов. Однако, существующие экспериментальные модели не воспроизводят в полной мере типичные для человека клинические стадии и признаки развития атеросклероза. Несмотря на многочисленные исследования, проводимые на этих экспериментальных моделях, до сих пор не удалось определить ведущие этиологические факторы атеросклероза или доказать, что ими являются факторы, которыми вызывают заболевание у экспериментальных животных. Одной из наиболее привлекательных сегодня гипотез, о причинах развития атеросклероза является гипотеза, согласно которой окисление липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) приводит к их модификации и развитию на них аутоиммунной реакции.

Аутоиммунная реакция в рамках этой гипотезы рассматривается или как ведущий этиологический фактор заболевания, или как одно из основных патогенетических звеньев. Однако, имеющиеся сегодня данные об уровне аутоантител к окисленным ЛПНП у больных атеросклерозом и здоровых людей противоречивы, однозначной связи между уровнем аутоантител к окисленным ЛПНП и атеросклерозом не обнаружено . В то же время существуют факты, указывающие, что мишенью аутоиммунной реакции могут быть не окисленные, а нативные ЛПНП (нЛПНП). В частности, об этом свидетельствует тот факт, что уровень аутоантител против нЛПНП при атеросклерозе выше, чем у здоровых людей . Недавно полученные результаты исследований, указывают на то, что аутоиммунные Т-клетки, распознающие эпитопы апопротеина В100 нативных ЛПНП, способствуют развитию атеросклероза, тогда как ингибирование Т-клеточного ответа против нативных ЛПНП подавляет развитие атеросклероза . Поэтому можно предположить, что причиной дислипопротеинемии и атерогенеза является развитие аутоиммунной реакции к нативным ЛПНП. В соответствии с данной гипотезой развитие аутоиммунной реакции против нЛПНП у экспериментальных животных должно сопровождаться появлением дислипопротеинемии, атеросклеротическими изменениями стенки сосудов, подобных тем, что наблюдаются при атеросклерозе человека.

Одним из способов индукции аутоиммунных заболеваний у животных является иммунизация их гетерологичным антигеном, похожим на аутоантиген . В настоящей работе мы попытались индуцировать аутоиммунную реакцию к нЛПНП у крыс путем иммунизации их нативными липопротеинами низкой плотности человека.

Цель работы: проверить гипотезу о том, что экспериментально вызванная аутоиммунная реакция против нативных липопротеинов низкой плотности у крыс будет сопровождаться метаболическими и патофизиологическими изменениями, подобными изменениям при атеросклерозе у человека.

1. Разработать схему иммунизации крыс нативными липопротеинами низкой плотности человека, вызывающую против них гипериммунный ответ.

2. Исследовать кинетику антител к нативным липопротеинам низкой плотности человека, аутоантител к нативным липопротеинам низкой плотности, уровень холестерина липопротеинов низкой и высокой плотности, общего холестерина в сыворотке крыс, иммунизированных нативными липопротеинами низкой плотности человека.

3. Провести морфологический и гистологический анализ сердца и дуги аорты у крыс, иммунизированных нативными липопротеинами низкой плотности человека.

Положения, выносимые на защиту:

1. Иммунизация крыс нативными липопротенами низкой плотности человека вызывает аутоиммунную реакцию против нативных липопротеинов низкой плотности, которая сопровождается развитием дислипопротеинемии, увеличением объема периваскулярного, эпикардиального жира и атеросклеротическими изменениями в стенке дуги аорты.

2. Атеросклероз у крыс, вызванный иммунизацией нативными липопротеинами низкой плотности человека, может являться адекватной экспериментальной моделью атеросклероза человека.

Научная новизна исследования

Разработана новая экспериментальная модель атеросклероза крыс, вызванного иммунизацией нативными гетерологичными липопротеинами низкой плотности. Экспериментальная модель атеросклероза крыс воспроизводит характерные для атеросклероза человека метаболические и патофизиологические изменения, такие как дислипидемия, увеличение объема периваскулярного и эпикардиального жира, скопление лейкоцитов и отложение липидов в стенке сосуда, дезорганизация медии и разрушение интимы, и поэтому может рассматриваться как адекватная модель атеросклероза человека. Результаты исследования дают новые знания о механизмах развития

атеросклероза, получены убедительные факты в пользу гипотезы о ведущей роли аутоиммунной реакции против нЛПНП в развитии дислипопротеинемии и атеросклероза. Экспериментальная модель имеет эвристический потенциал и открывает перспективу для изучения причинно-следственных связей между процессами, вовлеченными в патогенез атеросклероза; механизмов срыва естественной толерантности к нЛПНП, ведущих к атеросклерозу.

Практическая значимость исследования

Экспериментальная модель атеросклероза открывает перспективу определения ранних диагностических маркеров атеросклероза, разработку новых средств диагностики, терапии и оценки их эффективности. Преимуществом модели атеросклероза крыс является воспроизводимость, экономичность, простота в исполнении. Экспериментальная модель атеросклероза может использоваться как в научных исследованиях, так и в образовательном процессе. Результаты исследования внедрены в учебный процесс в спецкурсах «Экспериментальная иммунология», «Клинической иммунология» магистерской программы «Иммунобиотехнология» на факультете медицинской биотехнологии ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет».

Апробация результатов исследований

Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на VIII, X конференциях иммунологов Урала «Актуальные проблемы фундаментальной и клинической иммунологии и аллергологии», (Сыктывкар, 2010, Тюмень, 2012); XI Международной заочной научно-практической конференции «Инновации в науке» (Новосибирск, 2012); II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», (Санкт-Петербург, 2012). По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 4 статьи в ведущих Российских рецензируемых научных журналах, входящих в Перечень изданий, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Структура диссертационной работы.

Работа изложена на 93 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, приложения. Список литературы включает 153 источника, среди которых 13 отечественных и 140 иностранных. Работа иллюстрирована 22 рисунками, 3 таблицами.

Заключение диссертации по теме «Клиническая иммунология, аллергология», Фомина, Ксения Владимировна

1. Однократная иммунизация крыс \Vistar нативными липопротеинами низкой плотности человека в дозе 200 мкг в неполном адъюванте Фрейнда вызывает у крыс продукцию аутоантител против нативных липопротеинов низкой плотности крысы.

2. Аутоиммунная реакция против нативных липопротеинов низкой плотности у крыс сопровождается развитием дислипопротеинемии, степень дислипопротеинемии зависит от уровня продукции аутоантител против нативных липопротеинов низкой плотности.

3. Дислипопротеинемия у крыс, вызванная иммунизацией нативными липопротеинами низкой плотности человека, сопровождается снижением уровня эфиров холестерина в тканях надпочечников, увеличением объема периваскулярной и эпикардиальной белой жировой ткани, скоплением лейкоцитов и отложением липидов в стенке дуги аорты, разрушением интимы, утолщением и обнажением медии.

4. Метаболические и патофизиологические изменения, вызванные у крыс иммунизацией нативными липопротеинами низкой плотности, подобны ранним признакам развития атеросклероза у человека.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Фомина, Ксения Владимировна, 2013 год

Литература

1. Бобрышев Ю.В. Клеточные механизмы атеросклероза: врожденный иммунитет и воспаление / Ю.В. Бобрышев, В.П. Карагодин, Ж.И. Ковалевская, [и др.] // Фундаментальные науки и практика. - 2010. - Т. 1, №4. - С. 140-148.

2. Ватутин Н.Т. Инфекция как фактор развития атеросклероза и его осложнений / Н.Т. Ватутин, В.А. Чупина // Кардиология. - 2000. - № 2. - С. 13-22.

3. Гланц С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. - М., 1999. - 459 с.

4. Грибанов Г.А. Методы анализа липидов. Лабораторный практикум для студентов химико-биологического факультета / А.Г. Грибанов; Калининский госуниверситет. - Калинин, 1980. - 51с.

5. Климов А.Н. Аутоиммунная теория патогенеза атеросклероза и новые пути его лечения / А.Н. Климов // Вестник Российской академии медицинских наук. -2003. -№12. -С.29-34.

6. Климов А.Н. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения // А.Н. Климов, Н.Г. Никульчева. - СПб.: Питер Ком, 1999. - 512 с.

7. Корепанов A.C. Идиотипические механизмы регуляции развития аутоиммунной реакции в экспериментальной модели аутоиммунной гемолитической анемии у мышей / A.C. Корепанов, Л.В. Бедулева, И.В. Меньшиков, A.B. Князев // Вестник Удмуртского университета. - 2012. -Серия 6 . Биология. Науки о земле. - № 2. - С. 62-67.

8. Меньшиков И.В. Аутоиммунные реакции в патогенезе атеросклероза / М.И. Макарова, Н.И. Булатова, Л.В. Бедулева, H.H. Абишева, М.Г. Поздеева, H.A. Сиднева, A.A. Санникова, Е.В. Обухова // Иммунология. - 2010. - № 5. -

9. Хлюстов В.Н. Аутоиммунные механизмы в патогенезе атеросклероза // Успехи современного естествознания. - 2007. - №12. - С. 66.

10. Хлюстов В.Н. Количественное определение аутоантител к липопротеинам низкой плотности / В. Н. Хлюстов // Клиническая лабораторная диагностика. 1999. - №4. - С. 17-20.

11. Хлюстов В.Н. Способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови / В.Н. Хлюстов // Патент на изобретение. - № 2137134. - 1999.

12. Челнокова Н.О. Клинико-морфологические основы моделирования гемодинамики в системе венечных артерий с учетом их взаимодействия с миокардом: (обзор) / Н.О. Челнокова, А.А Голядкина, О.А. Щучкина // Саратовский научно-медицинский журнал. - 2011. - Т.7, №4. - С. 762-768.

13. Ярилин А.А. Основы иммунологии / А.А. Ярилин. - М.: Медицина, 1999 - 607 с.

14. Afek A. Immunization of low-density lipoprotein receptor deficient (LDL-RD) mice with heat shock protein 65 (HSP-65) promotes early atherosclerosis / A. Afek, J. George, B. Gilburd, L. Rauova, I. Goldberg, J. Kopolovic, D. Harats, Shoenfeld Y. //J Autoimmun. - 2000. - 14. - P. 115-121.

15. Akishita M. Low testosterone level as a predictor of cardiovascular events in Japanese men with coronary risk factors / M. Akishita, M. Hashimoto, Y. Ohike, S. Ogawa, K. Iijima, M. Eto, Y. Ouchi // Atherosclerosis. - 2010. - Vol. 210. -

16. Alagona P. Jr. Beyond LDL cholesterol: the role of elevated triglycerides and low HDL cholesterol in residual CVD risk remaining after statin therapy / P. Alagona Jr. // Am J Manag Care. - 2009. - Vol. 15. - P.65-73.

17. Alviar C.L. Infectious atherosclerosis: is the hypothesis still alive? A clinically based approach to the dilemma / C.L. Alviar, J.G. Echeverri, N.I .Jaramillo, C.J. Figueroa, J.P. Cordova, A. Korniyenko, J. Suh, A. Paniz-Mondolfi // Med Hypotheses. - 2011,- Vol. 76.-P. 517-521.

18. Animal Models for Autoimmune and Inflammatory Disease / Current Protocols in Immunology. - 1996. - by John Wiley & Sons, Inc.

19. Ayada K. Chronic infections and atherosclerosis / K. Ayada, K. Yokota, K. Kobayashi, Y. Shoenfeld, E. Matsuura, K. Oguma // Ann N Y Acad Sci. - 2007. -Vol. 1108. - P. 594-602.

20. Bachar G.N. Epicardial adipose tissue as a predictor of coronary artery disease in asymptomatic subjects / G.N. Bachar, D. Dicker, R. Kornowski, E. Atar // Am J Cardiol. - 2012. - Vol. 110. - P. 534-538.

21. Barter P. HDL-C: role as a risk modifier/ P. Barter //Atheroscler Suppl. - 2011. -Vol. 12.-P. 267-270.

22. Beduleva L. Role of idiotype-anti-idiotype interactions in the induction of collagen-induced arthritis in rats / L. Beduleva, I. Menshikov // Immunobiology. -2010.-Vol.215. - P. 963-970.

23. Blessing E. Chlamydia pneumoniae induces inflammatory changes in the heart and aorta of normocholesterolemic C57BL/6J mice / E. Blessing, T.M. Lin , L.A. Campbell, M.E. Rosenfeld, D. Lloyd, C. Kuo // Infect Immun. - 2000. - Vol. 68.-P. 4765^768.

24. Blouin K. Androgen metabolism in adipose tissue: recent advances / K. Blouin, A. Veilleux, V. Luu-The, A. Tchernof// Мої Cell Endocrinol. - 2009. - Vol. 301. -P. 97-103.

25. Borkowski A.J. Equilibration of plasma and adrenal cholesterol in man / A.J. Borkowski, S. Levin, C. Delcroix, J.Klastersky // J Appl Physiol. - 1970. - Vol. 28.-P. 42^9.

26. Boullier A. Detection of autoantibodies against oxidized low-density lipoproteins and of IgG-bound low density lipoproteins in patients with coronary artery disease / A. Boullier, M. Hamon, E. Walters-Laporte, F. Martin-Nizart, R. Mackereel, J.C. Fruchart, M. Bertrand, P. Duriez // Clin Chim Acta. - 1995. - Vol. 238. - P. 1-10.

27. Buckley C.D. Why do leucocytes accumulate within chronically inflamed joints / C.D. Buckly // Rheumatology. - 2003. - Vol.42. - P. 1433-1444.

28. Che J. Serum autoantibodies against human oxidized low-density lipoproteins are inversely associated with severity of coronary stenotic lesions calculated by Gensini score / J. Che, G. Li, W. Wang, Q. Li, H. Liu, K. Chen, T. Liu // Cardiol J. - 2011. -Vol. 18. - P. 364-370.

29. Chen X.H. Helicobacter pylori infection enhances atherosclerosis in high-cholesterol diet fed C57BL/6 mice / X.H. Chen, J.B. Wang, Y.S. Wang, Z.M Liu, Y. Li // Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. - 2010. - Vol. 38. - P. 259-263.

30. Chisolm G.M. The oxidative modification hypothesis of atherogenesis: an overview / G.M. Chisolm, D. Steinberg // Free Radic Biol Med. - 2000. - Vol. 28. -P. 1815-1826.

31. Corona G. Testosterone, cardiovascular disease and the metabolic syndrome / G. Corona, G. Rastrelli, L. Vignozzi, E. Mannucci, M. Maggi // Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. - 2011. - Vol. 25. - P. 337-353.

32. Cziraky M.J. Targeting low HDL-cholesterol to decrease residual cardiovascular risk in the managed care setting / M.J. Cziraky, K.E. Watson, R.L. Talbert // J Manag Care Pharm. - 2008. - Vol. 14. - P. 3-28.

33. Daugherty A. Mouse models of atherosclerosis / A. Daugherty // Am J Med Sci. -2002.-Vol. 323.-P. 3-10.

34. De Pergola G. The adipose tissue metabolism: role of testosterone and dehydroepiandrosterone / G. De Pergola // Int J Obes Relat Metab Disord. - 2000. -Vol.24. - P. 59-63.

35. Dexter R.N. Stimulation of adrenal cholesterol uptake from plasma by adrenocorticotrophin / R.N. Dexter, L.M. Fishman, R.L. Ney // Endocrinology. -1970.- Vol.87. - P.836-846.

36. Djaberi R. Relation of epicardial adipose tissue to coronary atherosclerosis / R. Djaberi, J.D. Schuijf, J.M. van Werkhoven, et al. // Am J Cardiol. - 2008. - Vol. 102.-P. 1602-1607.

37. Drew A. Atherosclerosis. Experimental methods and protocols / A. Drew. - 243 c.

38. Engelmann M.G. Chronic perivascular inoculation with Chlamydophila pneumoniae results in plaque formation in vivo / M.G. Engelmann, C.V. Redl, J. Pelisek, C. Barz, J. Heesemann, S. Nikol // Lab Invest. - 2006. - Vol. 86. - P. 467-476.

39. Fabricant C.G. Virus-induced atherosclerosis/ C.G. Fabricant, J. Fabricant, M.M. Litrenta, C.R. Minick // J Exp Med. - 1978. - Vol. 148. - P. 335-340.

40. Fan J. Cholesterol-fed and transgenic rabbit models for the study of atherosclerosis / J. Fan, T. Watanabe // J Atheroscler Thromb. - 2000. - Vol. 7-P. 26-32.

41. Fazio S. Mouse models of hyperlipidemia and atherosclerosis / S. Fazio, M.F. Linton // Front Biosci. - 2001. - Vol. 6. - P. 515-525.

42. Franch A. Time course of antibodies against IgG and type II collagen in adjuvant arthritis. Role of mycobacteria administration in antibody production / A. Franch, S. Cassany, C. Castellote, M. Castell // Immunobiology. - 1994. - Vol. 190. - P. 93104.

43. Fukui M. Role of endogenous androgen against insulin resistance and atherosclerosis in men with type 2 diabetes / M. Fukui, Y. Kitagawa, H. Ose, G. Hasegawa, T. Yoshikawa, N. Nakamura // Curr Diabetes Rev. - 2007. - Vol. 3. - P. 25-31.

44. Fuster J.J. Animal models of atherosclerosis / J. J. Fuster, A.I. Castillo, C. Zaragoza, B. Ibanez, V. Andres // Prog Mol Biol Transi Sci. - 2012. - Vol. 105. -P. 1-23.

45. Galkina E. Immune and Inflammatory Mechanisms of Atherosclerosis / E.Galkina, K. Ley // Annu. Rev.Immunol. - 2009. - Vol. 27. - P. 165-197.

46. Galkina E. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent / E.Galkina, A. Kadi, J. Sanders, D. Varughese, I. J. Sarembock, K. Ley // The Journal of Experimental Medicine. - 2006. - Vol. 203. - No. 5. - P. 1273-1282.

47. Gebbers J.O. Atherosclerosis, cholesterol, nutrition, and statins-a critical review / J.O. Gebbers // German Medical Science. - 2007. - Vol. 5. - Doc 04.

48. George J. Autoimmunity in atherosclerosis: lessons from experimental models / J. George, A. Afek, B. Gilburd, D. Harats, Y. Shoenfeld // Lupus. - 2000. - Vol. 9. -P. 223-227.

49. George J. Induction of early atherosclerosis in LDL-receptor-deficient mice immunized with beta2-glycoprotein I / J. George, A. Afek, B. Gilburd, M. Blank, Y. Levy, A. Aron-Maor, et al. // Circulation. - 1998. - Vol. 98. - P. 1108-1115.

50. Godfried S. Potentiation of atherosclerotic lesions in rabbits by a high dietary level of vitamin E / S. Godfried, G.F. Combs, J. Saroca, L.A. Dillingam // British Journal of Nutrition. - 1989. - Vol. 61. - P. 607-617.

51. Gounopoulos P. Antibodies to oxidized low density lipoprotein: epidemiological studies and potential clinical applications in cardiovascular disease / P. Gounopoulos, E. Merki, L.F. Hansen, S.H. Choi, S. Tsimikas // Minerva Cardioangiol. - 2007. -Vol. 55.-P. 821-837.

52. Grummer R.R. A review of lipoprotein cholesterol metabolism: importance to ovarian function / R.R. Grummer, D.J. Carroll // J.Anim.Sci. - 1988. - Vol. 66. -P.3160-3176.

53. Gwynne J. T. Adrenal cholesterol uptake from plasma lipoproteins: Regulation by Corticotropin / J. T. Gwynne, D. Mahaffee, H. B. Brewer, JR., R. L. Ney // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1976. - Vol. 73, №. 12. - P. 4329-4333.

54. Hadjiisky P. Experimental models of atherosclerosis. Contribution, limits and trends / P. Hadjiisky, M.C. Bourdillon, Y. Grosgogeat // Arch Mai Coeur Vaiss. -1991.-Vol. 84.-P. 1593-1603.

55. Hansson G.K. Atherosclerosis and the immune system / G. K. Hansson, G.P. Berne // Acta Paediatr Suppl. - 2004. - Vol. 93. - P. 63-69.

56. Hansson G.K. Atherosclerosis-an immune disease: The Anitschkov Lecture 2007 /G.K. Hansson // Atherosclerosis. - 2009. - Vol. 202. - P. 2-10.

57. Hansson G.K. Inflammation and immune response in atherosclerosis / G.K. Hansson //Curr Atheroscler Rep. - 1999.-Vol. 1. - P. 150-155.

58. Henrichot E. Production of chemokines by perivascular adipose tissue: a role in the pathogenesis of atherosclerosis? / E. Henrichot, C.E. Juge-Aubry, A. Pernin, J.C. Pache, V. Velebit, J.M. Dayer, P. Meda, C. Chizzolini, C.A. Meier // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2005. - Vol. 25. - P. 2594-2599.

59. Hermansson A. Inhibition of T cell response to native low density lipoprotein reduces atherosclerosis / A. Hermansson, D. Ketelhuth, D. Strodthoff, et al. // J Exp Med. - 2010. - Vol. 207. - P. 1081-1093.

60. Holoshitz J. Arthritis induced in rats by cloned T lymphocytes responsive to

mycobacteria but not to collagen type II / J. Holoshitz, A. Matitiau, I. R. Cohen // J Clin Invest. - 1984. - Vol. 73. - P. 211-215.

61. Hulthe J. Antibody titers against oxidized LDL are not elevated in patients with familial hypercholesterolemia / J. Hulthe, J. Wikstrand, A. Lidell, I. Wendelhag, G.K. Hansson, O. Wiklund // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 1998. - Vol. 18. -P. 1203-1211.

62. Iacobellis G. Epicardial adipose tissue: anatomic, biomolecular and clinical relationships with the heart/ G. Iacobellis, D. Corradi, A.M. Sharma // Nat Clin Pract Cardiovasc Med. - 2005. - Vol. 2. - P.536-543.

63. Iacobellis G. Epicardial adipose tissue: emerging physiological, pathophysiological and clinical features / G. Iacobellis, A.C. Bianco // Trends Endocrinol Metab. - 2011. - Vol. 22. - P.450-457.

64. Imaizumi K. Diet and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice / K. Imaizumi // Biosci Biotechnol Biochem. - 2011. - Vol. 75. - P. 1023-1035.

65. Jawien J. Mouse models of experimental atherosclerosis / J. Jawien, P. Nastalek, R. Korbut // J Physiol Pharmacol. - 2004. - Vol. 55. - P. 503-517.

66. Jiang X. Oxidized low density lipoproteins~do we know enough about them? / X. Jiang, Z. Yang, A.N. Chandrakala, D. Pressley, S. Parthasarathy // Cardiovasc Drugs Ther.-2011,- Vol. 25. - P. 367-377.

67. Karabinos I. Increased serum titers of autoantibodies against oxidized LDL cholesterol in young healthy adults /1. Karabinos, S. Koulouris // Atherosclerosis. -2007. - Vol. 192. - P. 448-450.

68. Kern J.M. Chlamydia pneumoniae-induced pathological signaling in the vasculature / J.M. Kern, V. Maass, M. Maass // FEMS Immunol Med Microbiol. -2009.-Vol. 55. - P.131-139.

69. Kojic Z.Z. Animal models in the study of atherosclerosis / Z.Z. Kojic // Srp Arh Celok Lek. -2003. - Vol. 131. - P. 266-270.

70. Kruif M.D. Chlamydia pneumoniae infections in mouse models: relevance for atherosclerosis research / M.D. de Kruif, E.C. van Gorp, T.T. Keller, J.M. Ossewaarde, H. ten Cate // Cardiovasc Res. - 2005. - Vol. 65. - P. 317-327.

71. Kruth H.S. Macropinocytosis is the endocytic pathway that mediates macrophage foam cell formation with native low density lipoprotein / H.S. Kruth, N.L. Jones, W. Huang, B. Zhao, I. Ishii, J. Chang, C.A. Combs, D. Malide, W.Y. Zhang // J Biol Chem. - 2005. - Vol. 280. - P. 2352-2360.

72. Kruth H.S. Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles / H.S. Kruth // Curr Opin Lipidol. - 2011. - Vol. 22. - P. 386-393.

73. Krysiak R. Current views on the role of dehydroepiandrosterone in physiology, pathology and therapy / R. Krysiak, D. Frysz-Naglak, B. Okopien // Pol Merkur Lekarski. - 2008. - Vol. 24. - P. 66-71.

74. Kurano M. Etiology of atherosclerosis-special reference to bacterial infection and viral infection / M. Kurano, K. Tsukamoto // Nihon Rinsho. - 2011. - Vol. 69. -P. 25-29.

75. Leinonen J.S. The level of autoantibodies against oxidized LDL is not associated with the presence of coronary heart disease or diabetic kidney disease in patients with non-insulin-dependent diabetes mellitus / J.S. Leinonen , V. Rantalaiho, P. Laippala, O. Wirta, A. Pasternack, H. Alho, O. Jaakkola, S. Yla-Herttuala, T. Koivula, T. Lehtimaki // Free Radic Res. - 1998. - Vol. 29. - P. 137-141.

76. Li J.Z. A long-term follow-up study of serum lipid levels and coronary heart disease in the elderly / J.Z. Li, M.L. Chen, S. Wang, J. Dong, P. Zeng, L.W. Hou // Chin Med J. - 2004. - Vol. 117. P. 163-167.

77. Libby P. Inflammation in Atherosclerosis:Transition From Theory to Practice / P. Libby, Y. Okamoto, V.Z. Rocha, et al. // Circ J. 2010. - Vol. 74. - P. 213-220.

78. Liuba P. Acute Chlamydia pneumoniae infection causes coronary endothelial dysfunction in pigs / P. Liuba, E. Pesonen, I. Paakkari, S. Batra, A. Forslid, P. Kovanen et al. // Atherosclerosis . - 2003. - Vol. 167. - P. 215-222.

79. Lopes-Virella M.F. Atherosclerosis and autoimmunity / M.F. Lopes-Virella, G. Virella // Clin Immunol Immunopathol. - 1994. - Vol. 73. - P. 155-167.

80. Maggio M. Welcoming low testosterone as a cardiovascular risk factor / M. Maggio, S. Basaria //Int J Impot Res. - 2009. - Vol. 21. - P. 261-264.

81. Mahabadi A.A. Association of pericoronary fat volume with atherosclerotic plaque burden in the underlying coronary artery: a segment analysis / A.A Mahabadi, N. Reinsch, N. Lehmann, J. Altenbernd, H. Kalsch, R.M. Seibel, R. Erbel, S. Mohlenkamp // Atherosclerosis. - 2010. - Vol. 211. - P. 195-199.

82. Mammi C. Androgens and Adipose Tissue in Males: A Complex and Reciprocal Interplay / C. Mammi, M. Calanchini, A. Antelmi, F. Cinti, G. Rosano, A. Lenzi, M. Caprio, A. Fabbri // International Journal of Endocrinology. - 2012. -doi:10.1155/2012/789653

83. Mandal K. Autoimmune mechanisms of atherosclerosis / K. Mandal, M. Jahangiri, Q.Xu // Handb Exp Pharmacol. - 2005. - Vol. 170. - P. 723-743.

84. McNamara D. J. Dietary cholesterol and atherosclerosis / D. J. McNamara // Biochim Biophys Acta. - 2000. - Vol. 1529. - P. 310-320.

85. Medras M. Testosterone and dehydroepiandrosterone deficiency, general adiposity and visceral obesity during normal male aging / M. Medras, E.A. Jankowska // Pol Merkur Lekarski. - 2001. - Vol. 11. - P. 187-190.

86. Meier C.A. White adipose tissue, inflammation and atherosclerosis / C.A. Meier,S. Thalmann // Bull Acad Natl Med. - 2007. -Vol. 191. - P. 897-908.

87. Menshikov I. Evidence in favor of a role of idiotypic network in autoimmune hemolytic anemia induction: theoretical and experimental studies / I. Menshikov, L. Beduleva // Int Immunol. - 2008. - Vol. 20. - P. 193-198.

88. Mironova M. Isolation and characterization of human antioxidized LDL autoantibodies./ M. Mironova, G. Virella, M.F. Lopes-Virella // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 1996. - Vol. 16. - P. 222-229.

89. Moghadasian M.H. Experimental atherosclerosis: a historical overview / M.H. Moghadasian // Life Sci. - 2002. - Vol.70. - P. 855-865.

90. Mussa F.F. Chlamydia pneumonia and vascular disease: an update / F.F. Mussa, H. Chai, X .Wang, Q. Yao, A.B. Lumsden, C. Chen // J Vase Surg. - 2006. - Vol. 43. -P. 1301-1307.

91. Nandakumar K.S. Collagen type II (Cll)-specific antibodies induce arthritis in the absence of T or B cells but the arthritis progression is enhanced by Cll-reactive

T cells / K.S. Nandakumar, J. Backlund, M. Vestberg // Arthritis Res Ther. - 2004. -Vol. 6. - P. 544-550.

92. Nilsson J. The B cell in atherosclerosis: teaming up with the bad guys? / J. Nilsson, G.N. Fredrikson // Clin Chem. - 2010. - Vol. 56. - P. 1789-1791.

93. Ohman M.K. Perivascular visceral adipose tissue induces atherosclerosis in apolipoprotein E deficient mice / M.K. Ohman, W. Luo, H. Wang, C. Guo, W. Abdallah, H.M .Russo, D.T. Eitzman // Atherosclerosis. - 2011. - Vol. 219. -P. 33-39.

94. Ouwens D.M. The role of epicardial and perivascular adipose tissue in the pathophysiology of cardiovascular disease / D.M. Ouwens, H. Sell, S. Greulich, J.Eckel // J Cell Mol Med.- 2010. - Vol.14. - P. 2223-2234.

95. Palinski W. Antisera and monoclonal antibodies specific for epitopes generated during the oxidative modification of low density lipoprotein // W. Palinski, S. Yla-Herttuala, M.E. Rosenfeld, S. Butler, S.A. Socher, S. Parthasarathy, L.K .Curtiss, J.L. Witztum // Arteriosclerosis. - 1990. - Vol. 10. - P. 325-335.

96. Parthasarathy S. Atherogenesis / S. Parthasarathy. - C.507

97. Parthasarathy S. Oxidized low-density lipoprotein, a two-faced Janus in coronary artery disease? / S. Parthasarathy, N. Santanam, N. Auge // Biochem Pharmacol. -1998.-Vol. 56.-P. 279-284.

98. Pasqui A.L. Immune factors in atherosclerosis / A.L. Pasqui, G. Bova, S. Maffei, A. Auteri//Ann Ital Med Int. -2005.-Vol. 20.-P.81-89.

99. Payne G.A. Epicardial perivascular adipose tissue as a therapeutic target in obesity-related coronary artery disease / G.A. Payne, M.C. Kohr, J.D. Tune // Br J Pharmacol. - 2012. - Vol. 165. - P. 659-669.

100. Rabkin S.W. Epicardial fat: properties, function and relationship to obesity / S.W. Rabkin // Obes Rev. - 2007. - Vol. 8. - P. 253-261.

101. Ravnskov U. A hypothesis out-of-date: The diet-heart idea / U. Ravnskov // Journal of Clinical Epidemiology. - 2002. - 55. - P. 1057-1063.

102. Ravnskov U. The fallacies of the lipid hypothesis / U. Ravnskov // Scand Cardiovasc J. - 2008. - Vol. 42. - P. 236-239.

103. Ritskes-Hoitinga J. Atherosclerosis in the rat / J. Ritskes-Hoitinga, A.C. Beynen //Artery. - 1988.-Vol. 16.-P. 25-50.

104. Rose N.R Infection, mimics, and autoimmune disease / N.R. Rose // J Clin Invest. - 2001. - Vol. 107. - P. 943-944.

105. Rossi G.P. Antibodies to oxidized lowdensity lipoproteins and angiographically assessed coronary artery diseasein white patients / G.P. Rossi, M. Cesari, R. De Toni, M. Zanchetta, G. Maiolino, L. Pedon, C. Ganzaroli, P. Maiolino, A.C. Pessina // Circulation. - 2003. - Vol. 108. - P. 2467-2472.

106. Sacks H.S. Human epicardial adipose tissue: a review / H.S. Sacks, J.N. Fain // Am Heart J. - 2007. - Vol. 153. - P. 907-917.

107. Saikku P. Serological evidence of an association of a novel Chlamydia, TWAR, with coronary heart disease and acute myocardial infarction / P. Saikku, K. Mattila, M.S. Nieminen et al. // Lancet. - 1988. - Vol.2. - P. 983-986.

108. Sarin S. Clinical significance of epicardial fat measured using cardiac multislice computed tomography / S. Sarin, C. Wenger, A. Marwaha, A. Qureshi, B.D. Go, C.A. Woomert, K. Clark, L.A. Nassef, J. Shirani // Am J Cardiol. - 2008. - Vol. 102. -P. 767-771.

109. Shah P.K. Residual risk and high-density lipoprotein cholesterol levels: is there a relationship? / P.K. Shah // Rev Cardiovasc Med. - 2011. - Vol. 12. - P. 55-59.

110. Shi G. P. Immunomodulation of vascular diseases: atherosclerosis and autoimmunity/ G.P. Shi // Eur J Vase Endovasc Surg. - 2010. - Vol. 39. - P. 485-494.

111. Singh V. Models to Study Atherosclerosis: A Mechanistic Insight / V. Singh, R.L. Tiwari, M. Dikshit, M.K. Barthwal // Current Vascular Pharmacology. - 2009. -Vol. 7.-P. 75-109.

112. Spagnoli L.G. Role of Inflammation in Atherosclerosis / L.G. Spagnoli, E. Bonanno // The Journal of Nuclear Medicine. - Vol. 48, № 11. - P. 1800-1815.

113. Spence J.D. Infection, Inflammation, and Atherosclerosis / J. D. Spence, J. Norris // Stroke. - 2003. - Vol. 34. - P.333-334.

114. Spiroglou S.G. Adipokines in periaortic and epicardial adipose tissue: differential expression and relation to atherosclerosis / S.G. Spiroglou,

C.G.Kostopoulos, J.N. Varakis, H.H. Papadaki // J Atheroscler Thromb. - 2010. -Vol. 17.-P. 115-130.

115. Stassen F.R. Infection and atherosclerosis. An alternative view on an outdated hypothesis / F.R. Stassen, T. Vainas, C.A. Bruggeman // Pharmacol Rep. - 2008. -Vol. 60. - P. 85-92.

116. Steinberg D. The LDL modification hypothesis of atherogenesis: an update /

D. Steinberg // J. Lipid Res. - 2009. - Vol. 50. - P. 376-381.

117. Steinberg D. An interpretive history of the cholesterol controversy: part I / D. Steinberg // Journal of Lipid Research. - 2004. - Vol. 45. - P. 1583-1593.

118. Steinberg D. An interpretive history of the cholesterol controversy: part II: the early evidence linking hypercholesterolemia to coronary disease in humans / D. Steinberg // Journal of Lipid Research. - 2004. - Vol. 46. - P. 179-190.

119. Stocker R. Role of oxidative modifications in atherosclerosis / R. Stocker, J.F. Keaney Jr. // Physiol Rev. - 2004. - Vol. 84. - P. 1381-1478.

120. Streblow D.N. Do pathogens accelerate atherosclerosis? / D.N. Streblow, S.L. Orloff, J.A. Nelson // J Nutr. - 2001. - Vol. 131. - P. 2798-2804.

121. Sulzer B., Central immune system, the self and autoimmunity / B. Sulzer, J. Van Hemmen, U. Behn // Bull. Math. Biol. - 1994. - Vol. 56. - P. 1009-1040.

122. Swanborg, R.H. Animal models of human disease. Experimental autoimmune encephalomyelitis in rodents as a model for human demyelinating disease / R.H. Swanborg // Clin. Immunol. Immunopathol. - 1995. - Vol. 77. - P. 4-13.

123. Szasz T. Perivascular adipose tissue: more than just structural support / T. Szasz, R.C. Webb // Clin Sci (Lond). - 2012. - Vol. 122. - P. 1-12.

124. Takahashi M. Inflammatory cytokines in the pathogenesis of atherosclerosis / M. Takahashi / Nihon Rinsho. - 2011. - Vol. 69. - P. 30-33.

125. Thalmann S. Local adipose tissue depots as cardiovascular risk factors / S .Thalmann, C.A. Meier // Cardiovasc Res. - 2007. - Vol. 75. - P.690-701.

126. Thompson G.R. History of the cholesterol controversy in Britain / G.R. Thompson //QJM. - 2009. - Vol. 102. - P.81-86.

127. Traish A. M. Dehydroepiandrosterone (DHEA)-a precursor steroid or an active hormone in human physiology / A.M. Traish, H.P. Kang, F. Saad, A.T. Guay // J Sex Med. - 2011. - Vol. 8. - P. 2960-2982.

128. Traish A.M. Testosterone and cardiovascular disease: an old idea with modern clinical implications / A.M. Traish, K.E. Kypreos // Atherosclerosis. - 2011. -Vol. 214(2).-P. 244-248.

129. Trentham D.E. Humoral and Cellular Sensitivity to Collagen in Type II Collagen-Induced Arthritis in Rats / D.E. Trentham, A. Townes, H. Andrew, J. R. David // J Clin Invest. - 1978. - Vol. 61. - P. 89-96.

130. Tsai W.C. Relation between antibody against oxidized low-density lipoprotein and extent of coronary atherosclerosis / W.C. Tsai, Y.H. Li, T.H. Chao, J.H. Chen // J Formos Med Assoc. - 2002. - Vol. 101. - P. 681-684.

131. Turk J.R. Physical activity and atherosclerosis: which animal model? / J.R. Turk, M. H. Laughlin // Can J Appl Physiol. - 2004. - Vol. 29. - P. 657-683.

132. Tuttolomondo A. Atherosclerosis as an Inflammatory Disease / A. Tuttolomondo, D. Di Raimondo, R. Pecoraro, V. Arnao, A. Pinto, G. Licata // Curr Pharm Des. - 2012. - Vol. 18. - P. 4266-4288.

133. Uusitupa M.I. Autoantibodies against oxidized LDL do not predict atherosclerotic vascular disease in non-insulin-dependent diabetes mellitus / M.I. Uusitupa, L. Niskanen, J. Luoma, P. Vilja, M. Mercuri, R. Rauramaa, S. Ylä-Herttuala // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 1996. - Vol. 16. - P. 1236-1242.

134. Vanderlaan P.A. Thematic review series: the immune system and atherogenesis. The unusual suspects:an overview of the minor leukocyte populations in atherosclerosis / P.A. Vanderlaan, C.A. Reardon // J Lipid Res. - 2005. - Vol. 46. -P. 829-838.

135. Veniant M.M. Lipoprotein size and atherosclerosis susceptibility in Apoe(-/-) and Ldlr(-/-) mice / M.M. Veniant, S. Withycombe, S.G. Young // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2001. - Vol. 21. - P. 1567-1570.

136. Verhagen S.N. Perivascular adipose tissue as a cause of atherosclerosis / S.N. Verhagen, F.L. Visseren // Atherosclerosis. - 2011. - Vol. 214. - P. 3-10.

137. Virella G. Atherogenesis and the humoral immune response to modified lipoproteins / G. Virella, M.F. Lopes-Virella // Atherosclerosis. - 2008. - Vol. 200. -P. 239-246.

138. Wang J.-L. Correlation of Inflammatory Cells in Adventitia and Formation and Extending of Atherosclerotic Lesions in Coronary Artery of Apolipoprotein E Gene Knockout Mice / J-L. Wang, S.-Q. Ma, L. Li, G-Q. Liu, Wei-C. Hu, R. Ma // Chinese Journal of Physiology. - 2012. - Vol. 56. - doi: 10.4077/CJP.2013.BAA080.

139. Weverling-Rijnsburger A.W. High-density vs low-density lipoprotein cholesterol as the risk factor for coronary artery disease and stroke in old age / A.W. Weverling-Rijnsburger, I.J. Jonkers, E. van Exel, J. Gussekloo, R.G. Westendorp // Arch Intern Med. - 2003. - Vol. 163. - P. 1549-1554.

140. Wick G. Role of heat shock protein 65/60 in the pathogenesis of atherosclerosis / G. Wick, R. Kleindienst, G. Schett, A. Amberger, Q. Xu // Int Arch Allergy Immunol. - 1995.-Vol. 107. - P. 130-131.

141. William R. Ware The mainstream hypothesis that LDL cholesterol drives atherosclerosis may have been falsified by non-invasive imaging of coronary artery plaque burden and progression / R. William // Med Hypotheses. - 2009. - Vol. 73. -P. 596-600.

142. Wozniak S.E. Adipose tissue: the new endocrine organ? A review article / S.E. Wozniak, L.L. Gee, M.S. Wachtel, E.E. Frezza // Dig Dis Sci. - 2009. -Vol. 54. - P.1847-1856.

143. Wucherpfennig K. W. Mechanisms for the induction of autoimmunity by infectious agents / K. W. Wucherpfennig // J Clin Invest. - 2001. - Vol. 108. -P. 1097-1104.

144. Xu F. Adventitial fibroblasts are activated in the early stages of atherosclerosis in the apolipoprotein E knockout mouse / F. Xu, J. Ji, L. Li, R. Chen, W.C. Hu // Biochem Biophys Res Commun. - 2007. - Vol. 352. - P. 681-688.

145. Xu Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts / Q. Xu // Am J Pathol. - 2004. - Vol. 165 - P. 1-10.

146. Yanni A.E. The laboratory rabbit: an animal model of atherosclerosis research / A.E. Yanni // Lab Anim. - 2004. - Vol. 38. - P. 246-256.

147. Yerramasu A. Increased volume of epicardial fat is an independent risk factor for accelerated progression of sub-clinical coronary atherosclerosis / A. Yerramasu, D. Dey, S. Venuraju, D.V. Anand, S. Atwal, R. Corder, D.S. Berman, A. Lahiri // Atherosclerosis. - 2012. - Vol. 220. - P. 223-230.

148. Yorgun H. Epicardial adipose tissue thickness predicts descending thoracic aorta atherosclerosis shown by multidetector computed tomography / H. Yorgun, U. Canpolat, T. Hazirolan et al. // Int J Cardiovasc Imaging. - 2012. - Vol. 28. -P. 911-919.

149. Yoshida H. Front line of oxidized lipoproteins: role of oxidized lipoproteins in atherogenesis and cardiovascular disease risk/ H. Yoshida // Rinsho Byori. -2010. -Vol. 58. - P. 622-630.

150. Zaragoza C. Animal Models of Cardiovascular Diseases / C. Zaragoza, C. Gomez-Guerrero, J.L. Martin-Ventura et al. // Journal of Biomedicine and Biotechnology. -2011. -doi:10.1155/2011/497841.

151. Zhao D. Oxidized Low-Density Lipoprotein and Autoimmune Antibodies in Patients With Antiphospholipid Syndrome With a History of Thrombosis / D. Zhao, H. Ogawa, X. Wang, G. S. Cameron, D. E. Baty, J. S. Dlott, D. A. Triplett // Am J Clin Pathol.- 2001. - Vol. 116. - P. 760-767.

152. Zhao Q. Inflammation, autoimmunity, and atherosclerosis / Q. Zhao // Discov Med. - 2009. - Vol. 8. - P. 7-12.

153. URL: http://www.kalenbiomed.com/34product_oldl.html (дата обращения 01.10.12).

Исследование выполнено при поддержке ФЦП Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение № 14.В37.21.0211; АВЦП Министерства образования и науки РФ «РНПВШ (2009-2011 годы)», № 2.1.1/2157; государственного заказа Министерства образования и науки РФ на проведение НИР по теме «Аутоиммунные механизмы атеросклероза. Новая экспериментальная модель атеросклероза у крыс» № 4.5505.2011.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.

Differential effect of Pistacia vera extracts on experimental atherosclerosis in the rabbit animal model: an experimental study
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2917426/

Липид-обогащенные диеты и окислительный стресс являются факторами риска развития атеросклероза. Эффекты метанольных (ME) и циклогексановых (CHE) экстрактов гайки Pistacia vera, часто включаемые в средиземноморскую диету, изучались в кроличьей модели атеросклероза.

Двадцать четыре новозеландских белых кролика получали атерогенную диету (контрольная группа), дополненную ME (группа ME) или CHE (группа CHE) в течение 3 месяцев. Ранее для исследования химических профилей экстрактов были разработаны GC-MS и UHPLC LC-DAD-ESI (-) — HRMS / MS. Образцы крови на начальном и месячном уровнях липидного профиля, перекисное окисление липидов и функция печени. Аорту, миокард и печень гистологически исследовали через 3 месяца.

Группы ME и CHE имели значительно более высокий уровень ЛПВП и не значительно меньший средний уровень ЛПНП холестерина в% от исходного уровня, чем контрольная группа. Триацилглицерин был значительно выше в группе CHE против контроля. Значения MDA были значительно ниже в группе ME по сравнению с контролем и CHE. ALT и AST были значительно выше в группе CHE против Control. γ-GT был ниже в группе ME по сравнению с контролем. Толщина интимы аорты была значительно меньше в группах ME и CHE против контроля; Атеросклеротические поражения группы ME были значительно менее обширными по сравнению с контролем групп и CHE. Только у группы CHE была значительная жировая инфильтрация печени.

Во время кратковременного введения одновременно с атерогенной диетой оба экстракта P. vera были полезны для HDL-, LDL-холестерина и толщины интимы аорты. ME дополнительно представил антиоксидантный эффект и значительное уменьшение поверхностных повреждений аорты. Эти результаты показывают, что диетическое включение P. vera, в частности ее ME, потенциально выгодно при управлении атеросклерозом.

Сердечно-сосудистые заболевания являются ведущей причиной смертности в промышленно развитой части мира, основным состоянием которой является атеросклероз . Развитие и прогрессирование атеросклеротических поражений изучено широко. Было проведено множество клинических исследований в отношении диетических протоколов, таких как исследование «Семь стран» средиземноморской диеты, которое включает оливковое масло . Другие клинические исследования включали фармацевтические и хирургические вмешательства только или в комбинации . Научные свидетельства патогенеза и терапии атеросклероза в прошлом веке получили в значительной степени протоколы исследований на животных моделях.

Кролик, одна из наиболее важных моделей для изучения атеросклероза, быстро реагирует на стимуляцию атеросклеротических поражений с помощью диеты с высоким содержанием холестерина . Некоторые диетические исследования использовали эту модель, в том числе введение оливкового или рыбьего жира и различных экстрактов семян или масел, полученных из семян подсолнечника, арахиса, семян льна или фундука . Пищевая гайка, потребляемая либо отдельно, либо как ингредиент в традиционных рецептах, — это фисташковый орех из дерева Pistacia vera, который принадлежит к семейству Anacardiaceae и распространяется в центральной и юго-восточной Греции, а также в других странах Средиземноморья и Ближнего Востока. Насколько нам известно, опубликованы только исследования in vitro относительно его биологически активного воздействия на развитие атеросклероза . Поэтому мы стремились исследовать влияние введения P. vera cyclohexane (CHE) и метанольного экстракта (ME) на экспериментальную модель кроликов атеросклероза на биохимию сыворотки, а также поражение аорты, сердца и печени.

В таблице 1 показаны описательная статистика измеренных параметров 3-х групп. В таблице 2 показаны средние изменения в процентах от исходных показателей биомассы организма, липидного профиля и антиоксидантного статуса, а также общие статистические значения. В таблице 3 показаны средние изменения в процентах от исходного уровня активности ферментов печени и общие статистические значения. В таблице 4 показан морфометрический анализ аорты кроликов.

Описательная статистика: средние значения ± стандартное отклонение массы тела и биохимических параметров

Средние значения веса тела, профиля липидов и окислительного стресса в течение периода наблюдения в трех группах: контроль (атерогенная диета), ME (атерогенная диета плюс ME), CHE (атерогенная диета плюс CHE).

Все переменные представлены как среднее ± SD

Процент изменения массы тела, профиля липидов и окислительного стресса в сыворотке кролика

Медиана% изменяется от исходного уровня массы тела, липидного профиля и значений окислительного стресса в течение периода наблюдения в трех группах: контроль (атерогенная диета), ME (атерогенная диета плюс ME), CHE (атерогенная диета плюс CHE).

Значительная разница при р

b Значительная разница при p

Процент изменения активности ферментов печени в сыворотке кроликов

Медиана активности ферментов печени% изменяется от исходного уровня в течение периода наблюдения в трех группах. Группа контроля: атерогенная диета, группа ME: атерогенная диета плюс ME, группа CHE: атерогенная диета плюс CHE

Значительная разница при р

b Значительная разница при p

Общий Sig: Общая значимость, NS: Незначительное

Морфометрический анализ на аортах кролика

Результаты выражены как медиана ± SD.

Группа контроля: атерогенная диета, группа ME: атерогенная диета плюс ME, группа CHE: атерогенная диета плюс CHE

Значительная разница при р

b Значительная разница при p

Конечное среднее изменение% от базовой линии в группах Control, ME и CHE не было статистически значимым (таблица 2), хотя наблюдалось умеренное увеличение абсолютных средних значений (таблица 1).

Уровни липидов в плазме всех трех групп были сходными на исходном уровне. Среднее изменение% от базовой линии в течение периода наблюдения, описанного ниже, показано в таблице 2.

Среднее изменение% от базовой линии до 1-го месяца для групп ME и CHE было статистически достоверно выше по сравнению с контрольной группой (p = 0,01 и 0,05 соответственно).

Среднее изменение группы CHE было статистически значимо выше по сравнению с контролем групп и ME в 1-й и 2-й месяцы, тогда как группы ME и CHE имели статистически значимые более высокие значения, чем контрольная группа во 2-м (p = 0,001 и p

Среднее изменение группы CHE было статистически значительно ниже по сравнению с контрольной группой в 1-м и 2-м месяце (p

Медиана% изменения группы ME была статистически достоверно выше по сравнению с контрольной группой в 1-й и 2-й месяцы (р

Среднее изменение группы CHE было статистически значимо выше по сравнению с группой ME во 2-м и 3-м месяце (p = 0,032 и 0,012 соответственно). Более того, среднее изменение группы МЭ статистически значимо отличалось по сравнению с контрольной группой в 1-м и 3-м месяце (p

Медиана% изменения группы ME была статистически достоверно выше по сравнению с контрольной группой во 2-м месяце (p = 0,05), тогда как среднее изменение группы CHE по сравнению с контрольной группой было значительно выше во время исследования (p

Медиана% изменения значений плазмы всех групп не показывала статистически значимого увеличения за весь экспериментальный период, когда группа CHE имела более высокие значения только в 3-м месяце (p = 0,007).

Среднее изменение значений группы ME по статистике было статистически значимым ниже по сравнению с контролем групп и CHE в течение третьего месяца эксперимента (p

Макроскопические образцы аорты из группы Control и CHE показали обширные атеросклеротические бляшки, покрывающие почти всю верхнюю часть вырезанной аорты (таблица 4 и фиг.1A и 1E). Показатели группы ME показали менее обширные поражения по сравнению с группой A, а также по сравнению с группой CHE (таблица 4 и фиг.1C).

Макро- и микроскопические изображения представителей аорты у кроликов трех групп. 1A, 1C, 1E являются репрезентативными изображениями из грубых образцов аорты, принадлежащих группам Control, ME и CHE, соответственно. Стрелки указывают на образования атеросклеротических бляшек. Как показано, контрольная группа демонстрировала обширные атеросклеротические бляшки, покрывающие почти всю верхнюю часть вырезанной аорты. Группы ME и CHE проявляли менее обширные поражения по сравнению с контрольной группой, и между этими двумя группами группа ME имела наименьшее образование поражения. 1B, 1D, 1F — микрофотографии с 1A, 1C, 1E соответственно (эозин — гематоксилин, первоначальное увеличение × 100). На рисунке 1B (контрольной группы) показана уязвимая доска с множеством пенных клеток, воспаление и замечательное утолщение интимы. Рисунок 1D (группа ME) показывает вышеописанное поражение, но менее обширная (толщина интима / среды меньше, чем в 1B. Рисунок 1F (группа CHE) демонстрирует эндотелий аорты с подтверждением утолщения и многих пенных клеток, однако интима / среда Отношение меньше, чем в 1 В. Стрелки указывают ширину эндотелия.

Гистопатологические данные группы Control и CHE показали уязвимые бляшки со многими пенными клетками, воспаление и замечательное утолщение интимы (рис.1B и 1F). В группе ME обнаружены описанные выше поражения, но менее обширные (рис.1D).

Гистологическое исследование сердца не выявило значительных изменений между группами.

Гистологическое исследование печени не выявило значительных изменений между Групповым контролем и МЭ. Группа CHE показала статистически значимую жировую инфильтрацию по сравнению с контрольной группой.

Негенетический гиперлипидемический кролик — это животная модель, широко используемая при исследованиях атеросклероза. Различные уровни диетического холестерина (0,2-1,3%) были использованы для создания эксперимента экспериментально , а одновременное введение других потенциально полезных веществ изучалось в периоды, варьирующие от 8 до 14 недель .

Заводы Pistacia — это деревья или кустарники, принадлежащие Греции и другим странам Средиземноморья и Ближнего Востока. Было показано, что среди них было обнаружено, что у P. lentiscus антиоксидант , антибактериальный , печеночно-защитные и цитостатические эффекты и для предотвращения холестерина ЛПНП от окисления in vitro . Было показано, что P. terebinthus оказывает полезное действие на маточные кондиломы и меланомы кожи . На P. vera было проведено мало исследований. Сообщалось, что он обладает противогрибковыми эффектами растений . P. vera ME содержит небольшие количества катехина, полифенольного флавоноида, который показывает потенциально более высокую антиоксидантную активность, чем аскорбиновая кислота и α-токоферол в исследованиях in vitro . Катехин и его продукты также были указаны как факторы снижения риска сердечно-сосудистых заболеваний путем снижения уровня холестерина в сыворотке, уменьшения агрегации тромбоцитов и снижения артериального давления .

В настоящем исследовании мы исследовали влияние совместного введения P. vera на прогресс индуцированного холестерином атеросклероза модели животного кролика в течение 12 недель. Мы решили отдельно управлять ME или CHE P. vera в разных группах животных, чтобы иметь возможность идентифицировать, какие компоненты будут отвечать за потенциально разные результаты. Анализ GC-MS CHE показал, что его основными соединениями являются b-ситостерол, сквален, стигмастерин, олеиновая и пальмитиновая кислоты. Клинические испытания уже показали защитные эффекты таких растительных стеролов при развитии ишемической болезни сердца . Кроме того, анализ МЭ с использованием методов LC-HRMS / MS выявил присутствие галлового метилового эфира, протокатехиновой кислоты и галловой кислоты. Показано, что галлова кислота обладает антиатерогенной активностью .

Результаты настоящего исследования показывают положительный эффект совместного введения P. vera ME и CHE в обогащенной холестерином диете при изменениях HDL-C. ME также продемонстрировало меньшее изменение MDA от исходного уровня, тем самым проявляя мягкий антиоксидантный эффект. Благоприятный эффект ЛПНП-С не был статистически значимым. Другие исследованные биохимические параметры (TC, TAG и ферменты печени) не продемонстрировали положительного эффекта ME при анализе данных с использованием средних средних значений. Анализ наших данных с использованием средних абсолютных значений показал статистически значимый защитный эффект МЭ по вышеуказанным параметрам (табл. 1). Однако из-за отсутствия нормального распределения значений, использование непараметрического анализа (тесты Крускал-Уоллиса и Манна-Уитни) было сочтено необходимым.

Несколько растительных веществ оказывают благотворное влияние на биохимию крови у кроликов, получающих холестерин. Полифенол оливкового масла, известный как гидрокситирозол, увеличивал уровни HDL-C атерогенных кроликов с диетическим питанием . Мука из кунжута благотворно влияла на общий уровень холестерина и триглицеридов у кроликов, получавших холестерин . Кроме того, сециолаларицирезиновый диглюкозид (SDG), лигнин растений, выделенный из льняного семени при введении кроликам в течение 8 недель, приводил к уменьшению LDL-C и увеличению ЛВП-C и антиоксидантной активности , аналогично нашему исследованию. Кроме того, в другом исследовании на кроликах с использованием этанольного экстракта лизимахиоидов Hypericum Boiss var lysimachioides (Guttifera) показано статистически значимое снижение уровней MDA, а также увеличение уровней HDL-C, что согласуется с нашим исследованием .

Наши результаты показали, что лечение обоими экстрактами P. vera вызывает умеренное увеличение значений TC, хотя это не сильно отличается от контрольной группы во втором и третьем месяце введения.

Средние значения HDL-C в контрольной группе были ниже в конце эксперимента, тогда как совместное введение экстрактов P. vera (группы ME и CHE) значительно ингибировало это снижение. Учитывая, что низкий уровень HDL-C связан с более высоким риском сердечно-сосудистых заболеваний, подтверждается, что увеличение уровня HDL-C приведет к защитному эффекту против атеросклероза после длительного введения экстрактов P. vera.

Наши результаты показали значительные различия в уровнях MDA в плазме между МЭ и контрольными группами. Это говорит о том, что положительный эффект P. vera ME на некоторые липиды и аорту может быть вызван мягким антиоксидантным эффектом.

В нашем исследовании уровни ферментов печени увеличились, достигнув максимальных уровней третьего месяца во всех группах. В частности, изменения ALT и AST были увеличены в группах ME и CHE по сравнению с контролем. Как клинические, так и экспериментальные исследования показали, что повышенные АЛТ и АСТ могут быть прогностическими для развития атеросклероза . Кроме того, изменения γGT группы ME были статистически значительно ниже в третьем месяце по сравнению с контрольной группой. Это свидетельствует о положительном эффекте P. vera ME и CHE в функции желчной системы атеросклеротических животных. В исследовании Hakimoglu et al. печеночная гидропическая и липидная дегенерация была снижена в этанольном экстракте лисимахоидов Hypericum по сравнению с кроликами, получавшими только с обогащенной холестерином диетой. Этот вывод похож на наш, где гистология печени, которую я кормила кроликов, была менее затронута, чем группа холестерина (контрольная группа), хотя статистически значимой разницы не было. В частности, кролики контрольной группы страдали от повреждения печени, характеризующегося стеатозом и фиброзом, что было еще более очевидным в группе CHE.

Макроскопическое образование бляшек в группе ME было менее обширным по сравнению с контролем групп и CHE. Как и в нашем исследовании, другие исследователи отметили, что, несмотря на увеличение уровня холестерина в сыворотке после введения экстракта, результаты патологии образцов аорты могут показать улучшение атеросклероза . Aguilera et al. обнаружили, что девственные оливковое масло и рыбьего жира уменьшают развитие атеросклеротических бляшек. Было также показано, что масло орехового ореха уменьшает атеросклеротические поражения в аорте холестерина, питающегося кроликами . Кроме того, эффект введения зеленого чая, содержащий соединения, полученные из эпикатехина у кроликов, оказал благотворное влияние на артериальные атеросклеротические бляшки . Это согласуется с нашими результатами, что свидетельствует о значительном положительном эффекте P. vera ME на развитие атеросклероза аорты. В частности, группа ME продемонстрировала значительное ингибирование атеросклеротических бляшек как по их толщине, так и по ширине в просвете аорты. Это может быть связано с основными компонентами МЭ, такими как галльная кислота и катехин, которые могут быть ответственны за этот процесс ингибирования, как уже указывалось . С другой стороны, группа CHE проявляла более мягкое ингибирование атеросклероза относительно толщины бляшек, что можно объяснить наличием b-ситостерола, сквален, стигмастерола, олеиновой и пальмитиновой кислот, как показано аналогично .

Группа CHE проявила самую низкую антиоксидантную активность. Этот эффект может быть связан с обширными, но не столь сложными атеросклеротическими поражениями, наблюдаемыми в образцах аорты группы CHE, по сравнению с таковыми для группы Control и ME. Однако группа ME проявила гораздо более сильную антиоксидантную активность. Статистически значимый наблюдаемый антиоксидантный эффект МЭ, очевидный при анализе MDA, также значительно уменьшает осаждение аортальной бляшки. С другой стороны, CHE не влиял на степень атеросклеротических поражений. Эти данные могут быть отнесены к компонентам P. vera ME, оказывающим антиоксидантную активность .

В заключение, при кратковременном введении одновременно с атерогенной диетой оба экстракта P. vera были полезны для HDL-, LDL-холестерина и толщины интимы аорты. ME дополнительно представил антиоксидантный эффект и значительное уменьшение поверхностных повреждений аорты. Эти результаты показывают, что диетическое включение P. vera, в частности ее ME, потенциально может быть полезным при лечении атеросклерозом. P. vera ME и CHE впервые используются in vivo в наших знаниях при изучении атеросклероза и показывают многообещающий эффект в отношении процесса ингибирования. Больше исследований требуется до того, как P. vera может быть клинически рекомендована для диетического включения для управления атеросклерозом.

Двадцать четыре обычных новозеландских белых кролика (2,7 ± 0,2 кг), приобретенных у греческого сертифицированного коммерческого заводчика, были случайным образом разделены на три равные группы (контроль, ME и CHE) и содержались отдельно в клетках из нержавеющей стали с бесплатным доступом к пище и водопроводной воды. Условия животного жилища составляли 20 ± 2 ° C, относительная влажность 60 ± 5%, в 12:12 ч свет: темный цикл. Животных обрабатывали в соответствии со стандартами, установленными Европейской директивой 86/609 / EEC. Местные ветеринарные органы и комитет по этике животных одобрили (лицензия № K / 950) исследование. Контрольная группа получила стандартную сбалансированную диету с кроликом (химический состав: общая жирная кислота 2,5%, целлюлоза — 18,5%, общий белок — 16,5%, вода — 13%, зола — 11%, кальций — 1,4%, лизин — 0,6%, метионин-цистин — 0,55%, фосфор 0,55%, натрий 0,25%), обогащенный 1% холестерина (Dolder, Швейцария) (атерогенная диета), группа ME получила атерогенную диету плюс ME (1% по весу) и атерогенную диету группы CHE плюс CHE (5% по массе) , Диеты были свежеприготовлены каждые три дня перед употреблением.

Количество порошкообразных фисташковых орехов на 15 кг, собранных на греческом острове Эгина, экстрагировали при комнатной температуре, сначала обезжиривали циклогексаном, получая 7,5 кг зеленого масляного остатка после выпаривания растворителя. CHE омыляли обычной процедурой, приводящей к этерифицированным жирным кислотам. Метиловые эфиры жирных кислот и неосажденный остаток анализировали с помощью GC и GC / MS с получением в качестве основных соединений b-ситостерола, сквален, стигмастерола, олеиновой кислоты и пальмитиновой кислоты (см. Дополнительный файл 1)
,

После извлечения порошкообразных фисташковых орехов циклогексаном растительный материал дополнительно экстрагировали дихлорметаном, получая 1,5 кг зеленого маслянистого экстракта, а затем метанолом с получением остатка 500 г после выпаривания растворителя. Количество 400 г остатка подвергали смоле XAD-4 для удаления сахара и получали ME, обогащенные фенольными соединениями. Для описания химического профиля обогащенного экстракта был разработан метод LC-DAD-ESI (-) — HRMS / MS. Анализ проводили с использованием устройства UHPLC, подключенного к высокоэффективному гибридному спектрометру LTQ-Orbitrap Discovery. В качестве стандартов для анализа использовались фенольные соединения, галоидный метиловый эфир (1), галловая кислота (2), протокатехиновая кислота (3) катехин (4) и эпикатехин (5), а их идентификация была выполнена путем сравнения времени удерживания, UV-Vis и высокоточные масс-спектры пиков в образце с образцами стандартных соединений.

В прилагаемом дополнительном файле 1 представлен подробный анализ компонентов экстрактов.

Все животные голодали за 12 часов до взятия крови. Они были слегка успокоены (кетамин гидрохлорид 12 мг / кг, ксилазин 2,5 мг / кг массы тела, им) для процедуры, чтобы избежать стрессового воздействия. Образцы крови из ушной артерии животных помещали в пробирки Вассермана, содержащие антикоагулянт в течение 0, 1, 2 и 3 месяца экспериментальной процедуры. Плазму отделяли центрифугированием при 3500 об / мин в течение 15 мин. Общий уровень холестерина в плазме (ТС), холестерин липопротеинов высокой плотности (HDL-C), холестерин липопротеинов низкой плотности (LDL-C), концентрации триацилглицерина (TAG), сывороточная аланинаминотрансфераза (ALT), аспартат-аминотрансфераза (АСТ) и гамма-сыворотка активность глютамилтрансферазы (γGT) измеряли коммерческими наборами ферментативных тестов в соответствии с инструкциями производителя (Biomerieux, Lyon, France) с использованием автоматического анализатора (тип 7170A, Hitachi, Tokyo, Japan). MDA рассчитывали по ручному методу реактивных веществ тиобарбитуровой кислоты (TBARS), как описано Yagi . В конце экспериментального исследования и после последнего взятия пробы крови при седации кроликов эвтаназировали тиопенталом натрия (30 мг / кг внутривенно).

Аорта была удалена из артерии аорты в подвздошную бифуркацию. Ткани, прилипающие к адвентиции, удаляли, а аорту разрезали продольно вдоль средней вентральной стенки. Затем аорту фиксировали в 10% -ном фосфатном буферном растворе формалина. Сняли просветную поверхность каждого образца аорты, и изображение было сохранено в электронном виде. Разделы из всех образцов были получены из трех стандартных участков (непосредственно дистальных к ветви левой подключичной артерии, в седьмой межреберной артерии и непосредственно позади целиакии). Эти образцы были встроены в парафиновые блоки и окрашены гематоксилин-эозином. Гистопатологические атеросклеротические поражения аорты были классифицированы по классификации Стари , а толщина и площадь поверхности атеросклеротических поражений в стенке аорты были полуквантизированы с использованием автоматизированной системы анализа изображений . Вкратце, оцениваемые параметры: утолщение интимы, накопление пенных клеток, моноядерные инфильтраты, липидное ядро и образование волокнистых колпачков. Цифровые изображения были получены из слайдов с помощью фотомикроскопа (Nikon Eclipse 80i, Nikon Corp, Токио, Япония), оснащенного цифровой камерой (Nikon DS — 2 МВт). Все изображения были перенесены на ПК с соответствующим программным обеспечением (Image ProPlus v. 5.1, Media Cybernetics, MD, USA).

Сердце и печень взвешивали и фиксировали в 10% -ном фосфатном буферном растворе формалина. Были взяты стандартные секции, встроенные в парафиновые блоки для гематоксилин-эозина, а образцы миокарда дополнительно окрашивались трихромным пятном Массона.

Повреждения миокарда оценивались от 0 до 3 относительно интерстициального отека, фиброза и инфильтратов пенных клеток. Повреждения печени были классифицированы в четырех классах, как описано ранее , в отношении изменений архитектуры, жировой инфильтрации и фиброза.

Данные были выражены как средние значения ± стандартное отклонение (SD), а также медианные значения из-за нарушения нормальности. Для анализа нормальности параметров использовался тест Колмогорова-Смирнова.

Чтобы указать тенденцию в первые 3 месяца лечения, средний процент изменений после 1, 2 и 3 месяцев переменных был рассчитан. Сравнение процентного изменения от базового значения переменных в течение периода наблюдения и переменных гистопатологии между тремя группами было проанализировано с использованием теста Крускала-Уоллиса и теста Манна-Уитни (парные сравнения).

Все тесты были двусторонними, статистическая значимость была установлена при p

P.vera: Pistacia vera; ME: метанольный экстракт Pistacia vera; CHE: циклогексановый экстракт Pistacia vera; GC: газовая хроматография; МС: масс-спектрометрия; UHPLC: ультравысокая жидкостная хроматография; LC: жидкостная хроматография; DAD: детектор диодных матриц; ESI: ионизация электронного спрея; HRMS: масс-спектрометрия высокого разрешения; TC: общий холестерин; LDL-C: холестерин липопротеинов низкой плотности; HDL-C: холестерин липопротеинов высокой плотности; TAG: триацилглицерин: MDA: малоносный альдегид; ALT: аланинаминотрансфераза; АСТ: аспартатаминотрансфераза; γ-GT: гамма-глутамилтрансфераза; TBARS: реакционноспособные вещества тиобарбитуровой кислоты; SD: стандартное отклонение; SPSS: статистический пакет для социальных наук; SDG: сециолаларицирсинол диглюкозид.

КМ провела экспериментальное исследование, включающее общий обзор животных, подготовку диет, отбор проб крови, эвтаназию и составление рукописи. KG и MH подготовили экстракт циклогексана и метанола и соответствующие диеты, а также провели их анализ. GA и EP выполняли и координировали все этапы патологии образцов тканей. TK и DI участвовали в удалении тканей и подготовке рукописи. AP и AC способствовали разработке исследования. Премьер-министр провел проект по производству экстрактов пистаци. NT способствовала подготовке диет и рукописи. LAS и ID задумали дизайн исследования, скоординировали эксперименты и подготовили рукопись. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Методы приготовления циклогексановых и метанольных экстрактов. Подробная информация о методологии приготовления циклогексановых и метанольных экстрактов, включая 2 рисунка.

Нажмите здесь для файла

Д-р К. Марино признателен Греческому министерству развития сельских районов и продовольствия за поддержку и образовательный отпуск, а также профессору Д. Н. Перреа за ценную консультацию и поддержку в исследовании. Д-р Дантас признает Специальный счет для исследовательских грантов (№ 70/4/2591) Национального и Каподистрианского университета в Афинах за финансовую поддержку. Авторы признают биостатистика доктора А. Галаноса за экспертный статистический анализ исследования и признают экспертную помощь К. Перреа, К. Пападаки, Э. Дуси, Г. Пантелиса, П. Рапоса и З. Мертири во время экспериментов.

Современные проблемы науки и образования. Экспериментальные модели Результаты и обсуждение

Рекомендованный список диссертаций

Аутоантитела к модифицированным липопротеинам человека и их роль в атерогенезе 2005 год, кандидат биологических наук Жданова, Ольга Юрьевна

Идиотип-антиидиотипические взаимодействия как механизм индукции и развития аутоиммунных реакций 2009 год, доктор биологических наук Бедулева, Любовь Викторовна

Антитела к нейромедиаторам в механизмах стрессорных поведенческих реакций 2013 год, доктор медицинских наук Умрюхин, Алексей Евгеньевич

Похожие диссертационные работы по специальности «Клиническая иммунология, аллергология», 14.03.09 шифр ВАК

О возможности применения иммуномодуляторов для коррекции алкогольной мотивации 2005 год, кандидат биологических наук Кушнир, Екатерина Александровна

Заключение диссертации по теме «Клиническая иммунология, аллергология», Фомина, Ксения Владимировна

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Фомина, Ксения Владимировна, 2013 год